关于骨髓间充质干细胞的疑问

孙小牧

刚开始做细胞实验，按照丁香园里原代细胞的protocol操作的。# O" ^& H3 V2 r# y3 @7 K6 K  S: _
目前做了三次，每次都是完全培养液冲出骨髓，加到2倍体积分离液中离心之后，只分两层，没有像文献里说的那样分四层。
5 y# Z2 b: j3 K3 C想请教一下各位前辈，可能的原因是什么？
: V- t- y" N6 ~3 E; ~8 v& o+ ]- ]+ H分离股骨胫骨，完全培养液冲骨髓的操作应该没有问题。分离液是GE 17-0891-09的percoll细胞分离液。每次都是两倍体积分离液在下，缓慢加入冲过骨髓的培养液。
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iytbxxg

白细胞层本来就是很少，别把这一层忽略了。

孙小牧

回复 iytbxxg 的帖子1 l0 K3 d/ }* ~0 s0 O/ l) a+ |. V0 D
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做了三次都看不到白膜层，不知道是不是自己冲出来的骨髓太少，还是别的什么原因

卓俊文

骨髓量少，试试1:1

孙小牧

回复 卓俊文 的帖子
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谢谢指点

cmw930922

我个人觉得全骨髓法很实用，而且我不离心，直接把骨髓悬液冲到培养瓶中，效果很好。以下是我的方案
" e+ Q8 U8 u: F9 W  e7 `* s# p原代培养步骤
, U: N/ u9 |+ q: `6 ~; ?" [% d        1. 小鼠（3周龄）在水合氯醛下麻醉后处死，取双侧股骨、胫骨（保证骨头两端完好，去净肌肉组织），将完整的股骨放入含1%双抗的PBS中，将装有骨头的50ml离心管（一管30ml能装4、5根）放在泡沫箱（有冰袋）运输。0 o8 _; P% ?7 B) I3 f) j1 c
        2.消台20分钟，准备T25培养瓶，60mm培养皿，原代器械盒（外科手术剪，镊子，血管钳，15ml注射器）% u. y' f1 t/ o& y, M$ P  h9 M
        3. 先将股骨浸泡在75%酒精3min，取出后PBS冲洗3遍（完全去除酒精），血管钳夹持股骨，手术剪剪去股骨两端骨骺，用5ml注射器抽取全培穿刺冲洗（一根骨头一只注射器），直接冲入tT25培养瓶（2ml培养基）（DMEM/F12+10%胎牛血清+1%双抗）。
$ d5 G( K5 b7 j. K        4. 48h后全量换液（期间不要剧烈摇晃培养瓶）+ ?: b7 e+ f3 Q( E8 P0 G