关于脂肪细胞（附图）

duoduo777001

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" y% f. \9 F7 [  P+ L
这段时间在同时做脂肪干细胞和外周血干细胞（兔），2个星期之前已经全部培养出，今天DAPI也以观察到。之前受到很多前辈的帮助，非常感谢，再此附上图片和各位分享一下。当然还有不足之处望指点。
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6 ~1 a% w0 b5 [2 l$ I$ PDAPI步骤：# R1 t- |& P/ H3 J: V: @( e. k
1.细胞计数后，至于6well培养皿中培养，2天
* b" z5 f* r% {& a2.去除用1ml/well 1XPBS washing 3times. 加入3.5%FPA 1ml/well 30min RT
. Y: E$ _$ X/ s0 [. ]3.1XPBS washing 10min 2times.加入0.2%tritonX-100 1ml/well 15min RT
) T2 Y3 Z! W# d- s. g# ^4.1XPBS washing 15min 3times.加入10ug/ml DAPI 1ml/well 15min RT1 x& v. C( b* C% p; F5 w
5.1XPBS washing 2times.与显微镜下观察。0 {# x$ J" s" F- j( N

3 V5 N) E# @" g) d* m20x Auto1 U+ r3 b3 @! x. {5 O' m3 v5 A. `! a9 g

9 b5 s" K& F0 p, F# e40Xmanual
- C1 b; m" Q* l& m) T6 X9 V4 `, {& b4 s- T

2 O0 a% p7 ^3 P: R8 H7 l- e' Q# T兔外周血（耳背取血）
1 {5 U) `+ n7 a# z20x Auto
9 f7 M; {8 e2 V: O$ s
% i6 o" L# ^3 c" I2 W5 b4 U. F" W5 r( k! D: Z' a. n
40Xmanual# R( K" K' @4 i1 ]5 H" c! S) j

duoduo777001

前面两张是人体脂肪干细胞的，后面两张是兔外周血干细胞

duoduo777001

我也是在这里请教了前辈以后做出来的。因为自己也是初学者，所以只能附上比较粗略的步骤。有些地方也值得探讨。" e+ Z/ X1 K) g" t
兔（耳背）外周血干细胞
* @3 [# K( w" t7 I8 C; J. @1、取血前3天分两次注入substanceP8 X( [+ F9 B- ~% C' t8 p- e
2、一只兔取血10ML，立刻实验。5 u& K0 d  ]( ^; g5 K3 b  O2 x. |/ L
3、我们用的是Histopaque+—1077，与血液的体积比是1:1，血液在上，注意加入时尽量不要让其相融。
7 v; w) O7 p5 M$ h' T; a4、400xg 30min RT
+ U0 D1 T# I9 }4 @7 c! c5、用pasteur pipet小心的取膜（约厚0.5cm），注意到新的tube中。
2 p. S7 N" S" h3 \; `1 R6 ?6.加入10ml1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清。
4 H3 J+ c3 u, t' C# a( Y7.在悬浮细胞，用5ml 1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清（重复一次）
& |$ E$ U5 z5 F9 O! I; Z8.加入0.5ml 1XPBS轻轻吹打，转移到培养皿中，加入1.5mlDMEM(10%pbs 1%p/s)6 O7 D+ K6 L1 o5 Y" `
大约要一段时间以后才能观察到。每三天换液一次。暂不传代。7 o; ?1 {' E' {( R( @$ }
3 S: f$ Z. |" W% ]$ _; K/ A- D
脂肪干细胞8 e6 M1 r/ Y4 [5 G2 ]
取人体脂肪，经处理去除麻醉剂等物质
3 k/ ^. z- U5 D1.配制collagense浓度为2mg/ml,1XPBS配制。与脂肪等体积混合, y: [( s5 M( `6 o
2.37℃，shaking，30分钟
" @) T* M8 v3 I, t! s3.过滤后，加入等体积DMED（10%PBS）。离心1800bpm 5min.弃上清
, ]6 x* W* S! }" W* ]; W4.加入3mlDMEM,离心,3次
2 u/ Z/ K2 \7 M  d- c0 s5.0.5ml 1XPBS混合，1.5mlDMED  （6well）
0 p8 ^) @3 q/ }6 w7 Z! j* p/ ~$ N# m8 e! h2 o# y
荧光实验方法如上，蓝色显影的荧光剂，加了抗体以后会用绿色的。荧光显微镜是奥林巴斯X71
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7 k1 g- d, U2 g$ O还有不足请指教（加一句，个人觉得第1张和第四张很像阿凡达里面精灵树的感觉。。。。。。O(∩_∩)O~）

duoduo777001

回复 13# purplerainzj # ]2 Q, I  F7 ~0 A6 ?4 `

2 _& O8 A# Z8 M/ g* G  M! @0 J) w8 V; D! s6 ~% S8 m* V
    我们用的脂肪是医院直接从人体身上取的，拿过来以后也只是用PBS反复清洗，直至去颜色略微发白。一般拿回来的脂肪10ml，用6well培养皿。传代我们用的也是最基本的方法。培养液用的是DMEM（10%FBS),目前传代已有7次左右，还未见老化现象。要注意的是提取的时候离心的速度对细胞生成有影响