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- 威望
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- 139
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我也是在这里请教了前辈以后做出来的。因为自己也是初学者，所以只能附上比较粗略的步骤。有些地方也值得探讨。
+ {% a2 U" o2 r7 G兔（耳背）外周血干细胞$ H9 z: b6 h# y
1、取血前3天分两次注入substanceP1 @1 K. J5 y V$ j% K) ?; `- v
2、一只兔取血10ML，立刻实验。
?: a6 e N, s5 p$ |; s9 z0 D, P) e/ P) j3、我们用的是Histopaque+—1077，与血液的体积比是1:1，血液在上，注意加入时尽量不要让其相融。
( ]: g! |2 u+ m9 y4 u/ ~. N4、400xg 30min RT
3 P' S0 x. b) j+ F. l5、用pasteur pipet小心的取膜（约厚0.5cm），注意到新的tube中。
0 [# j( I! m! d3 f2 |) O2 h6.加入10ml1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清。
: A# M, G& }4 D# _. B7 v7 c7.在悬浮细胞，用5ml 1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清（重复一次）$ K) L7 F# F9 d8 M* b7 `( ?
8.加入0.5ml 1XPBS轻轻吹打，转移到培养皿中，加入1.5mlDMEM(10%pbs 1%p/s)9 A6 z" d; h/ z/ i: r$ o
大约要一段时间以后才能观察到。每三天换液一次。暂不传代。
' n& N' C, X: h1 e/ J6 e' ]- O. Y Z( N, p( r/ Z9 {
脂肪干细胞
! p8 K! }6 ^* y/ }3 k5 ?取人体脂肪，经处理去除麻醉剂等物质
, Z( E% Y' ~% r; B1.配制collagense浓度为2mg/ml,1XPBS配制。与脂肪等体积混合7 ?4 C! T4 l& ?" I/ ]+ |
2.37℃，shaking，30分钟
+ t' a, n# a# e0 q7 p3.过滤后，加入等体积DMED（10%PBS）。离心1800bpm 5min.弃上清) @- v: k7 `9 F. G1 z( |
4.加入3mlDMEM,离心,3次
0 }! y2 {6 N, \, I5.0.5ml 1XPBS混合，1.5mlDMED （6well）) Y9 n a7 l' ?4 ~; w1 F- c
0 A8 h6 g- z3 a8 Z
荧光实验方法如上，蓝色显影的荧光剂，加了抗体以后会用绿色的。荧光显微镜是奥林巴斯X71
- u. ]8 F3 l9 [) B2 x- F+ E1 R0 S+ y
; M9 `6 o% Q% d- l还有不足请指教（加一句，个人觉得第1张和第四张很像阿凡达里面精灵树的感觉。。。。。。O(∩_∩)O~） |
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发表于 2010-4-22 19:16
