关于脂肪细胞（附图）

duoduo777001

3 r: a$ ]& X* e& w1 ^3 ^$ C/ I
9 P" g. i) i9 C! S4 L+ ]) g
这段时间在同时做脂肪干细胞和外周血干细胞（兔），2个星期之前已经全部培养出，今天DAPI也以观察到。之前受到很多前辈的帮助，非常感谢，再此附上图片和各位分享一下。当然还有不足之处望指点。
. u' C6 o3 G! ~0 k  Q# w+ A; a5 v- K. n( g3 ?1 H3 _
DAPI步骤：
/ z! {  u* V  P7 A  B+ u' S1.细胞计数后，至于6well培养皿中培养，2天
& D; S7 [& q" ?/ f' v- R" ~2.去除用1ml/well 1XPBS washing 3times. 加入3.5%FPA 1ml/well 30min RT
) z* G* l, b+ ^( K8 K1 ]3.1XPBS washing 10min 2times.加入0.2%tritonX-100 1ml/well 15min RT. e5 N' p9 A+ ]6 l7 l
4.1XPBS washing 15min 3times.加入10ug/ml DAPI 1ml/well 15min RT$ a+ g8 g- i5 k6 S
5.1XPBS washing 2times.与显微镜下观察。# c$ v9 I9 o3 d3 i
8 A9 B& Y4 l! n! d" i& h
20x Auto; s! j" Y* x0 K4 n9 q* R
; w" w+ J, m4 f% f" k# q7 s. v: {
40Xmanual
5 p, B5 ~4 b: Q  [1 c5 Z# ~+ E- C, A  z  k* L: _

/ q& y. c2 H( Q! \兔外周血（耳背取血）
' n; a6 z% U1 \9 F/ L  |$ |( P5 D20x Auto. `; G" }8 s. @, v
" }& i0 M) _; m# S2 }. ]& X/ a
% `+ ]3 H* Z; X3 u  Q7 F. D
40Xmanual
5 q9 ]. s, p& P9 `

duoduo777001

前面两张是人体脂肪干细胞的，后面两张是兔外周血干细胞

cm11011

图片很漂亮，谢谢分享经验！

可怜的孩子

漂亮的工作，学习了。想请教一下兔外周血你一次取了多少ml，能不能附上外周血干细胞培养的简单的protocol，谢谢

yczmc1211

你好。结果很欣慰，想请教一下你是通过什么方法从众多细胞里分出干细胞的呢，能描述一下大概步骤吗？非常感谢！！！！

liulilin

请问 这是经过怎样处理之后？能在显微镜下看到这么漂亮的照片。

ambassador

这段时间在同时做脂肪干细胞和外周血干细胞（兔），2个星期之前已经全部培养出，今天DAPI也以观察到。之前受 ...9 D3 K- a, I  _. v' z& c8 S! X
duoduo777001 发表于 2010-4-22 19:16

! A  K% _2 p: }$ N7 S
3 i+ t! r/ u" i2 F( l- J
) k# [7 j& m9 T3 h) `2 Z6 @# L    同问：你是如何从众多的细胞中分离出脂肪干细胞的呢？图片真的不错，是在荧光下拍摄的么？

haiyantang

非常漂亮，请问怎么分离的？

oldmac7

很受关注的课题, 以上所又的问题也是我想知道. 请楼主赐教.
% j$ H. u7 o. E0 p+ _请问如何培养人体脂肪干细胞和兔外周血干细胞?
6 n! P) M: b. |- \% H- N* m能不能把处理过程和PROTOCOL 贴上来?

duoduo777001

我也是在这里请教了前辈以后做出来的。因为自己也是初学者，所以只能附上比较粗略的步骤。有些地方也值得探讨。
1 s! a1 s( h) c5 S) b8 @4 g2 M兔（耳背）外周血干细胞/ W$ l" o4 S# C2 p8 _, U* `
1、取血前3天分两次注入substanceP& |: V* Z; ~$ I( t3 l2 B
2、一只兔取血10ML，立刻实验。- K* w5 A! E7 \
3、我们用的是Histopaque+—1077，与血液的体积比是1:1，血液在上，注意加入时尽量不要让其相融。+ f8 d$ e" w: p) ~8 k' `: R) Y
4、400xg 30min RT
5 T3 g* e3 k6 s. Y5、用pasteur pipet小心的取膜（约厚0.5cm），注意到新的tube中。
* E% Z; G5 q) R/ G6.加入10ml1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清。
! h2 D& n& E8 `! ?" Z& Z7.在悬浮细胞，用5ml 1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清（重复一次）
5 q8 X, ]3 G+ D, `' ?8.加入0.5ml 1XPBS轻轻吹打，转移到培养皿中，加入1.5mlDMEM(10%pbs 1%p/s); e$ G8 ]. i3 l1 F" K! t1 l, I
大约要一段时间以后才能观察到。每三天换液一次。暂不传代。. b8 Q1 x' r) C- ~# _6 e
& H) p% h! s+ p' Q* n8 h1 b
脂肪干细胞
) y5 p! d4 X' C& J' \取人体脂肪，经处理去除麻醉剂等物质7 O& w. T% Z' f& o8 f
1.配制collagense浓度为2mg/ml,1XPBS配制。与脂肪等体积混合
/ t: H6 A! F6 p- g% h2.37℃，shaking，30分钟
. g. n1 c+ ~4 B  H9 p, f4 m9 I3.过滤后，加入等体积DMED（10%PBS）。离心1800bpm 5min.弃上清2 O* C" F" t- l! b+ {
4.加入3mlDMEM,离心,3次# B2 D  m, j3 G; a, a/ c& k  W
5.0.5ml 1XPBS混合，1.5mlDMED  （6well）
) b2 a2 r6 Y7 ^3 p3 w& W- x* n. r& i/ t) O2 @  ]' n' N
荧光实验方法如上，蓝色显影的荧光剂，加了抗体以后会用绿色的。荧光显微镜是奥林巴斯X71
2 j2 L3 q. O! L6 Y3 q$ T" @% v+ c8 f6 {  h, N) l
还有不足请指教（加一句，个人觉得第1张和第四张很像阿凡达里面精灵树的感觉。。。。。。O(∩_∩)O~）