关于脂肪细胞（附图）

duoduo777001

+ v+ u' W% N* z& A; m" J3 Y. w7 L
! a" j# C3 P! {" k
这段时间在同时做脂肪干细胞和外周血干细胞（兔），2个星期之前已经全部培养出，今天DAPI也以观察到。之前受到很多前辈的帮助，非常感谢，再此附上图片和各位分享一下。当然还有不足之处望指点。
* {, R& D$ X% x( w2 U/ M& L& |
( L% N# ~! S3 aDAPI步骤：
) R# C0 Y" n8 N9 c1.细胞计数后，至于6well培养皿中培养，2天- D$ f: J$ P3 c- k  ]& l
2.去除用1ml/well 1XPBS washing 3times. 加入3.5%FPA 1ml/well 30min RT# u. E8 I. U/ m$ Y% W+ z) x; n; W
3.1XPBS washing 10min 2times.加入0.2%tritonX-100 1ml/well 15min RT5 g5 G$ k* j- g) [7 Z7 D8 j9 o8 q
4.1XPBS washing 15min 3times.加入10ug/ml DAPI 1ml/well 15min RT. H5 _9 d0 q3 x2 ^2 ^! h% N
5.1XPBS washing 2times.与显微镜下观察。
, s2 V. `: F/ T9 [  R7 r7 h
9 C& g$ D2 J) V; r/ R" F% u20x Auto) h; e" K- d' G4 B5 q, A

9 z& L* D6 }) g1 M' S* Y0 W40Xmanual( G( S% z  n7 U3 h
, X  Z. B* S* m" v) |3 \% b

. q8 b1 r2 I/ I" }( y兔外周血（耳背取血）
5 H% A5 k+ |& w# I( h5 i20x Auto4 H3 d* s! ^' \! e1 m6 Z
5 x( G9 M5 B# O' O" T2 f) f
# Z& p; u+ H; e; _, Q3 }0 k
40Xmanual2 V! x- m5 W4 |1 C' T  H1 T

duoduo777001

前面两张是人体脂肪干细胞的，后面两张是兔外周血干细胞

duoduo777001

我也是在这里请教了前辈以后做出来的。因为自己也是初学者，所以只能附上比较粗略的步骤。有些地方也值得探讨。
% v; f. Z* j1 E" k+ {兔（耳背）外周血干细胞  q8 M: b! T" C
1、取血前3天分两次注入substanceP
: P# {; g1 U6 c/ P8 S& o) }' i; b2、一只兔取血10ML，立刻实验。
5 `/ L8 q! ?/ g4 ]% G1 X0 I2 q3、我们用的是Histopaque+—1077，与血液的体积比是1:1，血液在上，注意加入时尽量不要让其相融。
. t6 v6 Y: N2 o" A8 y4、400xg 30min RT
* b3 s+ _* a& E3 {( k5、用pasteur pipet小心的取膜（约厚0.5cm），注意到新的tube中。' q& @* a1 d4 {$ m) k  o- N1 C
6.加入10ml1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清。* [: Q& i' R6 U8 J) r! T
7.在悬浮细胞，用5ml 1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清（重复一次）
: `1 h. Y! U0 v$ R, ~8.加入0.5ml 1XPBS轻轻吹打，转移到培养皿中，加入1.5mlDMEM(10%pbs 1%p/s)* A' I8 T8 c  M2 Z6 A
大约要一段时间以后才能观察到。每三天换液一次。暂不传代。
* m8 c2 t# k+ H: X: J  J* q8 @  u  X9 P# V9 [( X
脂肪干细胞
$ e% P5 M* _* M3 s+ d/ \+ i- ~取人体脂肪，经处理去除麻醉剂等物质
5 H: b. B' {7 v7 h' I& i9 J: s1.配制collagense浓度为2mg/ml,1XPBS配制。与脂肪等体积混合
* L' y, K( R6 }! E) ~2.37℃，shaking，30分钟3 z, R' c* M- v( x3 e6 C; {! k  }8 G
3.过滤后，加入等体积DMED（10%PBS）。离心1800bpm 5min.弃上清. _3 g  A6 a& t% o) o  }. |
4.加入3mlDMEM,离心,3次
7 w2 ^9 x, g5 u2 b0 q5.0.5ml 1XPBS混合，1.5mlDMED  （6well）" r! \- q5 ~, n/ ]) q; E% F

2 N( @* l( [4 ^9 r7 E% C$ y2 p: c荧光实验方法如上，蓝色显影的荧光剂，加了抗体以后会用绿色的。荧光显微镜是奥林巴斯X71( v/ q- ]8 l1 N- l, S! S
( v) \7 P5 L5 _+ j' j9 N
还有不足请指教（加一句，个人觉得第1张和第四张很像阿凡达里面精灵树的感觉。。。。。。O(∩_∩)O~）

duoduo777001

回复 13# purplerainzj
1 }4 c6 t; g* k9 H: _7 ~  W8 k
# Q2 k- I* U' [4 ^' A/ q3 b2 C5 e' y; B
    我们用的脂肪是医院直接从人体身上取的，拿过来以后也只是用PBS反复清洗，直至去颜色略微发白。一般拿回来的脂肪10ml，用6well培养皿。传代我们用的也是最基本的方法。培养液用的是DMEM（10%FBS),目前传代已有7次左右，还未见老化现象。要注意的是提取的时候离心的速度对细胞生成有影响