关于脂肪细胞（附图）

duoduo777001

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这段时间在同时做脂肪干细胞和外周血干细胞（兔），2个星期之前已经全部培养出，今天DAPI也以观察到。之前受到很多前辈的帮助，非常感谢，再此附上图片和各位分享一下。当然还有不足之处望指点。( S3 F- \' s% B) s5 _

2 f+ Z2 p7 C: D! Y: P9 D  j, h3 dDAPI步骤：
6 X2 ]4 d& J4 q: @' k0 j! M1.细胞计数后，至于6well培养皿中培养，2天
& h- b7 u( _' R4 C+ j6 S2.去除用1ml/well 1XPBS washing 3times. 加入3.5%FPA 1ml/well 30min RT! m6 T! M; `5 w. G3 S& x
3.1XPBS washing 10min 2times.加入0.2%tritonX-100 1ml/well 15min RT
' X, r3 [$ d/ e4.1XPBS washing 15min 3times.加入10ug/ml DAPI 1ml/well 15min RT! q# E) E  x, X) D
5.1XPBS washing 2times.与显微镜下观察。6 g- w7 k' P4 C% K
& p$ o, B& _5 G1 Y; l
20x Auto
4 Y* l4 ~9 k  W  f
* U* N1 e& f+ ?; }40Xmanual) ?1 I- g. A' F4 |. C) [2 L7 D

" T$ y$ k7 Y- v7 \( b3 y7 t# N! \, q- H4 L0 C6 q0 m3 e
兔外周血（耳背取血）
' m, I0 m2 @+ G4 s20x Auto
- \+ ?. T: _* _4 w0 |1 F6 t! T6 u1 Q' ?
6 F# W$ j( P9 @$ R5 L( m; _
40Xmanual
3 s* K+ d# f) r+ a" G2 C% I" L

duoduo777001

前面两张是人体脂肪干细胞的，后面两张是兔外周血干细胞

duoduo777001

我也是在这里请教了前辈以后做出来的。因为自己也是初学者，所以只能附上比较粗略的步骤。有些地方也值得探讨。+ N6 ?- r9 t; Y3 Y- {( `
兔（耳背）外周血干细胞
3 {# y& ?# k% \1、取血前3天分两次注入substanceP5 s- ~: M" N  s7 V7 i) y
2、一只兔取血10ML，立刻实验。1 F- o% v$ D1 g5 V/ |0 Z5 |) U1 l
3、我们用的是Histopaque+—1077，与血液的体积比是1:1，血液在上，注意加入时尽量不要让其相融。
+ c" s% n! j# L4 p' m4、400xg 30min RT% m! \: S- F6 W/ C9 S
5、用pasteur pipet小心的取膜（约厚0.5cm），注意到新的tube中。/ O1 I7 q' s2 k2 E' L+ Q6 l; Y- j
6.加入10ml1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清。8 q) K, s' x; s7 \2 {9 }
7.在悬浮细胞，用5ml 1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清（重复一次）' O8 r$ q* d- g4 Y8 ~8 S
8.加入0.5ml 1XPBS轻轻吹打，转移到培养皿中，加入1.5mlDMEM(10%pbs 1%p/s)
6 l8 M" T4 G$ c大约要一段时间以后才能观察到。每三天换液一次。暂不传代。* j  D; I+ i( H. S0 ]0 [2 u

/ R* Z1 @* Z4 T( |9 N脂肪干细胞9 ?: h9 c) ^, u9 t" l
取人体脂肪，经处理去除麻醉剂等物质( D  C/ ?. M% X: C& B- l/ t( T" F
1.配制collagense浓度为2mg/ml,1XPBS配制。与脂肪等体积混合
: V3 D* g& g5 V; x2.37℃，shaking，30分钟: [( X, ?; ]$ {* {
3.过滤后，加入等体积DMED（10%PBS）。离心1800bpm 5min.弃上清
0 e+ E2 y# O; H; v; P& n4.加入3mlDMEM,离心,3次6 ?5 v4 s0 f% m5 e, }" x
5.0.5ml 1XPBS混合，1.5mlDMED  （6well）
; F  [7 ~! f% G; w0 e7 F9 A: Y: q3 h( t3 w
荧光实验方法如上，蓝色显影的荧光剂，加了抗体以后会用绿色的。荧光显微镜是奥林巴斯X71
  e, M* [  Q" V( |4 F  ]6 c+ P  Z) P6 M5 _' a2 k! K
还有不足请指教（加一句，个人觉得第1张和第四张很像阿凡达里面精灵树的感觉。。。。。。O(∩_∩)O~）

duoduo777001

回复 13# purplerainzj ; }; g2 R8 A" P0 E

! x" R3 I- @5 N; o) v0 d
; @  J5 H1 a4 d4 |/ G2 {2 o    我们用的脂肪是医院直接从人体身上取的，拿过来以后也只是用PBS反复清洗，直至去颜色略微发白。一般拿回来的脂肪10ml，用6well培养皿。传代我们用的也是最基本的方法。培养液用的是DMEM（10%FBS),目前传代已有7次左右，还未见老化现象。要注意的是提取的时候离心的速度对细胞生成有影响