外泌体提取的7种方法及其优缺点

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外泌体提取的7种方法及其优缺点/ g, K' L$ _3 r8 {# O& d0 x
来源：流式中文网 2019-04-01 17:26' \% V, [! T8 S) d
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1、差速离心
2 k& W/ Q$ ~+ ~9 Q1 F差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。 该方法包括几个步骤，包括1）低速离心去除细胞和凋亡碎片，2）更高速离心以消除更大的囊泡，最后，3）高速离心沉淀外泌体：+ p, C* v7 S# p1 j  U5 k
不过需要注意的是，样本的粘度与分离的外泌体纯度有显着的相关性，因此，具有高粘度的生物样品（例如血浆和血清样本）需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。  f  T% q  t" I1 r  q
步骤： 以300×g离心10分钟，取上清。 以2000×g离心10分钟，取上清。 10，000×g离心30分钟，取上清。 100，000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100，000×g离心90分钟。
9 s5 `( U5 X  e' Q2、密度梯度离心6 j5 ^8 `" p  X1 n( n
该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。 因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体。 但是，合适的离心时间非常重要，否则如果它们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。 2018年Li K等人改良了此方案，回收率更高、纯度更高，并且结构和功能保持更好（Li K， Wong D， Hong K， Raffai R. Cushioned-Density Gradient Ultracentrifugation (C-DGUC)： A Refined and High Performance Method for the Isolation， Characterization， and Use of Exosomes. Methods Mol Biol. 2018；1740：69-83[1]）
* O4 ~8 J- T, v& f3、尺寸排阻色谱4 ]' y* h8 R- @' q/ E8 G1 M5 ?
尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量实现分离大分子。 该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。 尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。 此外，可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。 与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的结构。 目前，SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。 不过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。; p" n; ]- D' U
4、过滤
6 b; q# V, y8 K1 h& {超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。 最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体，也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体：& H$ {$ A# _" a" \
不过，该方法由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。, F( F; [( J; n  J  D
5、基于聚合物的沉淀技术! h! X* H, m: \8 c
基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合，在4℃温育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。用这种聚合物沉淀具有许多优点，包括对分离的外泌体影响小、pH中性等。目前大多数快速分离外泌体的商品化试剂盒都是基于此方法。 然而基于聚合物的沉淀方法可能会同时分离非囊泡污染物（包括脂蛋白）而且，聚合物材料的混杂可能会影响下游分析。
, w/ V: _7 H; ^6、免疫分离技术$ b+ n6 I* S4 \5 \" j
免疫分离外泌体的原理大多是通过抗体包被的微球，特异性结合外泌体。 例如使用抗肿瘤相关HER2和EpCAM的抗体从肿瘤细胞中分离出肿瘤来源的外泌体。 然而，使用抗体包被珠子的分离不适合从大量样本中获得外泌体。- l. d5 n8 D6 A, u1 l- w- L
还有将抗体包被于ELISA中的那种板上面，直接分离后检测、分析、定量。最近的一项研究已应用免疫亲和超顺磁性纳米粒子（ISPN）来结合外泌体，研究人员通过连接抗CD63抗体和纳米粒子生成ISPN，并用它们从体液中分离外泌体。3 y, Q9 K2 A, R( ?3 U% G
7、通过筛分分离1 j+ I- F! P6 T
该技术利用压力或电场，通过膜从样本中筛出外泌体：& k) G8 @3 {, \+ P' h" K
该方法分离时间短，可以提供较高纯度的外泌体。 但是回收率低。(生物谷Bioon.com）/ s/ X, ?5 Z1 {' a