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大三结束了，对近期读的文献做一个总结，最近主要看了ES表达调控机制，以及iPS细胞的最新文章，觉得重编程机制越来越清晰，这个是我个人的理解，希望对大家有所帮助，欢迎大家讨论！7 k2 Q4 N1 N8 T O6 v
谢谢论坛里给我提供文献的各位老师，师哥，师姐。谢谢！4 ]! I, x% Q+ P/ w
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自从2007年，山中申弥教授和Thomson教授分别用各自发现的4个因子成功实现分化细胞向多能细胞的转化以来，诱导多能干细胞（iPS）成为干细胞研究的热点。但是开始时谁也不知道具体的机制是什么。虽然许多实验室在多个物种上成功复制了实验结果，并且实现了许多技术上的改进，但是很少有人探讨其背后的机制是什么，iPS的研究逐渐遇到了瓶颈。这时人们才逐渐把目光转向重编程机制的探讨。有了过去近三年大量iPS实验经验的积累，几十年的ES细胞调控网络以及近半个世纪重编程（包括核移植和细胞融合）的研究，iPS的机制也逐渐变的明朗起来。) T9 e/ [6 A. t0 L5 m/ ?
1． 机制探讨
! O" k2 r' Y, [- q8 i越来越多的实验结果证明，iPS的实现大致需要分两步进行：% }# b1 N2 P4 m+ r
第一步：表观遗传的变化（Epigenetic alterations）
; X4 a4 V6 o3 K7 ]( v表观遗传因子不管是在干细胞还是在体细胞中都是普遍存在的，他们的靶点是某一功能的一群基因，而不是某一个基因，因此要实现靶向性必须依赖其他一些因子共同发挥作用。在ES细胞中，这些因子就是多能性因子，如Oct4，Nanog等。所以，iPS的重编程的启动机制是导入的多能基因的表达产物与相应的表观遗传因子结合，替换分化因子，从somatic-specific表达模式转变为ES-specific模式，使染色体的结构发生变化，使染色体变得更accessible，有利于多能性相关的基因的激活，以及分化和发育相关的基因沉默。比如，最近的一项研究表明，在MEF中，导入的Oct4能结合到BAF复合体上，使Baf155替换Baf170，从而使分化细胞特异性的BAF复合体转变为esBAF。esBAF复合体是一种chromatin remodeling complex，与ES多能性的维持有关。他能使染色体的结构发生变化，以利于基因的激活，同时他能与Oct4结合，促进Oct4与靶基因结合，从而促进重编程的过程。所以外源导入Baf155和Brg1（BAF复合体的另一个元件）能提高iPS的效率。, V+ Q5 l/ C8 o6 G7 }7 P
同时，在ESC分化的过程中，经过染色体修饰的多能基因，常发生DNA甲基化以实现更稳定，更持久的基因沉默。因此，Oct4等多能因子要激活下游的多能性相关基因，还面临甲基化的问题。所以重编程过程必须经历去甲基化的过程。对比三种重编程方法（细胞核移植，细胞融合，转录因子诱导）：细胞核移植和细胞融合的去甲基化不依赖于细胞分裂，因为去甲基化的因子（以及其他多能性因子）已经存在于卵细胞胞质或融合细胞的多能性细胞（研究表明是由AID介导）中了，是主动去甲基化的过程。而诱导的方法则不同，由于去甲基化因子并没有被提供，也可能去甲基化因子虽存在，但其发挥作用并不依赖于Oct4等多能性因子。所以去甲基化的过程是一个被动的过程，必须依赖于细胞分裂造成的基因的甲基化松动，多能性因子才能结合到靶基因上，激活多能基因的表达。所以在诱导的过程中，去甲基化是一个随机的过程，耗时也比核移植和细胞融合长的多（这或许也解释了另一个现象——核移植获得的ES细胞比iPS细胞重编程更完全：后者要经历从分化细胞特异的调控元件转变成多能性细胞特异的调控元件的过程，是被动的过程，而细胞融合和核移植的多能性细胞特异的各种调控元件却是现成的，是主动的过程。所以重编程过程更快，更彻底）。
% A# Q" z4 w( |5 N& _* n经历了上述表观遗传的变化后之后，外源因子才能更有效的发挥其作用，激活或者抑制下游基因的表达。使细胞逐渐达到多能的状态。在ES细胞中，多能因子之间常形成复合物，相互促进其功能，使调控更高效，重编程的过程也不会例外；另一种高效的调控方法可以通过激活或抑制某个信号通路来实现。因为信号通路将许多与某一功能相关的基因串联起来，轻微的改变上游某一个元件就能同时改变下游许多功能一致的基因的表达。比如，最新的研究结果表明，导入的因子Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc能抑制TGF-β通路，促进MET。在这一过程中，基因的表达谱由Mesenchymal-specific转变为Epithelial-specific。而后者相对于前者分裂速度更快，染色体也更accessible，反过来又利于后续的重编程。而以前的实验结果发现：通过抑制p53通路能提高重编程的效率。可能是因为p53能促进细胞的分裂（无限增殖的癌细胞内p53通路也被抑制），更有利于基因的去甲基化，从而促进重编程。另外，以前的结果也表明，激活Wnt通路也能促进重编程。可能是因为通过激活wnt通路能增加其效应因子Tcf3的数量，而Tcf3也是一个重要的维持多能性的因子。Tcf3能与Oct4结合，促进其对靶基因的调节。另外，在ES细胞内，常与Oct4和Nanog等多能型因子结合的因子还有STAT3和Smad1。而二者分别是LIF通路和BMP4通路的重要组成因子。两个通路都是ES多能性维持相关的通路。所以，重编程的过程或许与这两个信号通路有关。3 r; Q6 A# E5 M4 ?+ a" e
随着内源基因逐渐被激活，一些多能性相关的基因逐渐表达，干细胞的标记基因如SSEA也逐渐表达。而分化和发育相关的基因逐渐被沉默。: @$ Y2 |" s) d8 i: e& m9 ?
第二步：多能状态的维持(maintenance of pluripotency)
! `8 k# n. J3 m5 M3 F随着重编程的进行，导入的基因逐渐被沉默。细胞逐渐达到了一种平衡状态：内源的多能性因子相互之间必须形成自身的调节通路以维持其表达在某一个水平。在ES细胞中，Oct4通过和Sox2形成复合物，结合到共有的下游基因的启动子上，调节其表达，同时也结合到自身的启动子上，促进自身的表达（feedforward regulation）。2 |' W! _! v2 b; d( J$ g
在ES细胞中，核心调节因子（Oct4，Sox2，Nanog，Klf4）通过下面几种机制维持多能状态：
$ P# ]. k. L8 a' w+ ~# ]1. 协同作用（co-regulation） 也就是上面经常提到的，核心调节因子常常和其他因子之间形成复合物作用于同一个靶点，相互促进各自的作用。这种机制使下游基因的表达不会因为某一个因子的波动而发生变化，而当多个因子同时变化时，下游基因能很快发生相应的变化，从而使ES即维持稳定的状态，同时又保证了对外界变化的敏感性。+ N& n) E- b# L/ h
2. Molecular “Rheostats” 核心调控元件之间也常形成复合物发挥作用，如Oct4和Sox形成复合物，Nanog形成同源二聚体。而任何一种因子的表达升高或降低都会破坏这种作用，引起细胞发生分化。这种机制保证了ES细胞对于外界环境中的分化信号的敏感性。
" r2 j1 J; f" V) K3. 冗余现象（redundancy） 即ES的核心调控元件的功能可以被同一家族的其他因子所取代，发挥同样的作用。如Klf2和5能取代Klf4，Sox4,11和15能取代Sox2与Oct结合形成复合物发挥作用。这在iPS诱导的过程中也被证实。这种机制保证了ES状态的稳定性。1 X ~: Y9 B, Q1 G5 n) l7 V
iPS细胞达到的这种稳定状态或许和ESC中有相同的调节通路，表达相似的表面抗原，但是这并不意味着iPS的这个状态与ES的相同。iPS也必须保证多能状态的稳定性，同时也要确保对分化信号的敏感性，否则，体细胞就是不完全重编程（incomplete reprogramming），得到的iPS细胞就处在与ES一步之隔的某一个中间状态。并且，这个中间状态很难再用改变某几种因子的水平完成后续的重编程，因为导入的因子必须与其他因子co-regulation才能发挥作用，同时导入的外源因子也打破了已有的平衡，反而使细胞分化。这也解释了为什么12qF1未被激活的iPS细胞再导入OSKM四个因子却不能激活沉默的基因。' D+ Q9 q, g# j4 {# W
第一步的过程整体上看是随机的过程，更容易被人为的干预，并且直接影响第二步的平衡状态。并最终影响最终的重编程程度和效率。第二步似乎无法再有效干预，但是随着ES调控网络认识的深入，人为的干预或许也能达到一定的效果，并且相对于第一步随机的过程来说，第二步更有章可循。
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2. iPS的研究方向：
0 t2 @6 D1 y# ?& U7 S! o+ ^通过上面iPS细胞重编程机制的归纳，可以总结出iPS细胞的研究还可以从以下方面着手：- J9 b! ~- q& g, l0 u/ N' y
1． 外界环境（environment） 细胞状态的维持是内外环境共同作用的结果。并且，环境中的因子可以通过激活或抑制重编程相关的通路，影响重编程的过程。但是，重编程的过程是一个global的过程，而一个通路只是一个local的调控，所以重编程的过程可能涉及到很多个通路，而不能只用一种通路解释。例如，Baf155和Brg1对重编程的促进作用是通过改变染色体形态，促进Oct4结合到靶基因上实现的，似乎和TGF-β通路和MET无关。但是也不排除各个通路之间的相互交叉，串连成一个网络，达到牵一发而动全身的效果。但这也说明iPS细胞的研究对于基因的表达调控的研究也有重要的意义。同时也为筛选外用小分子提供了参考。& R, n& Z1 Q: u7 O
2． 转录因子（transcriptional involvement）/ Z2 G5 m' H6 p0 Z
与Oct4等共同作用的有的是表观遗传因子，有的是转录因子。相对于表观遗传变化来说，转录因子的研究时间更长，机制研究的也更清楚，与其他的调控网络建立起来的联系也更多，比如miRNA。因此转录因子的研究或许能将隐藏的重编程机制揭示出来，从而带来更多意想不到的惊喜。
0 d, o# T0 ~/ [+ `3． 表观遗传因子（epigenetic factors） BAF复合体对重编程的促进作用也告诉我们表观遗传因子在重编程中的重要地位，并且由于表观遗传因并不是ES-specific，在体细胞中也普遍存在，但是最初筛选重编程因子的思路是，选择ES-specific factors，这就造成了这些因子的漏选。比如，Oct4能与染色体去甲基化酶Jmjd1a和Jmjd2c共同作用，同BAF复合体类似，也能改变细胞的染色体结构，调节多能性相关因子的表达，如Nanog。另外DNA的甲基化在诱导的过程中是被动的过程，或许通过加入相应的去甲基化因子能扭转这一被动的局面，促进重编程。
8 o0 z v: t1 v) K, j. l8 E4． 重编程方法之间的相互借鉴（reciprocity between different reprogramming approaches）! F; u6 w' L: F2 U- R5 m
不同的重编程方法具体的机制可能不同。但是，无论哪种方法，都必须经过表观遗传的变化，都必须激活多能性相关的基因，抑制分化相关的基因，因此，在方法上还是有一定的借鉴意义的：比如，Wilmut在研究克隆羊的过程中，发现减少体细胞培养基中的血清有利于重编程，解释是减少血清有利于改变染色体的结构。而最近裴端卿教授的研究表明，去除培养基中的血清也能提高iPS的效率，但解释是血清中含有TGF-β，所以去除血清能抑制EMT，从而促进重编程。虽然解释不同，但方法却是相同的。同时，一些提高iPS细胞的方法或许也能促进核移植的重编程过程，例如，低氧，vitamin C等。* M+ Q, Q: Y, \1 `& z
! z+ B& ~+ P# ]4 M+ C
新的重编程相关关键因子的发现对于重编程机制的研究具有重大的意义，但是或许会带来新的担忧：我们好不容易将导入的因子从四个减到一个，现在却要增加因子。更多的因子意味着更大的插入突变的可能，因此安全性降低。因此，通过外界环境的变化，筛选小分子似乎显得更有价值。但是，重编程机制的阐明能够为将来用蛋白质和小分子诱导提供理论基础。并且随着载体系统的完善，插入突变的问题将不再是iPS技术要考虑的因素，那时更安全，更高效，重编程更彻底的iPS细胞将成为可能，使iPS细胞的潜能充分发挥出来。 |
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发表于 2010-6-30 23:35
