组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

1 I3 l# M! A2 K2 d  q. R2 w

1 U- P9 z. T- C- a具体步骤：
2 X2 \7 x5 a+ ^3 b1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟
" b  d! N  q; G4 y0 r4 D* J2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭* k1 ?4 }% i7 |6 f5 q
  ps.两种都试过，结果没有改善
. v+ J1 f) |& `5 y/ U1 T3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）5 Z/ K  Z$ I! X9 b6 ^! P- J  b! v
  4℃湿盒过夜9 f. r# z  `; w5 j5 q% D
4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min2 G" O. v* }$ ^+ W" k6 j* P8 z6 w
加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光
6 L% Z9 H2 u( h* U5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min" q! y5 {' Y# l! r* O2 t$ {) A
6.染核，PBS洗3次，每次5min
; k: O( n2 Z9 H$ V  {9 S0 [2 ~# ^7.封片，荧光显微镜下观察
. m' z1 w! J$ L0 ~4 a* u' C5 y& b! r$ @8 ~& @* p
结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。) o+ L7 L, H( y8 ?( [: J* ~. p
请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试$ W) Y" y% i7 i/ n, f1 b' N7 B) M  F
淡定 发表于 2010-7-16 13:05

. ?1 x2 A3 G3 {8 x0 U  _试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

请用IE浏览器下载
附件
下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。
# G% K2 [! d2 K2 r5 M. C6 o- C% m可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。# C) s& B& q- t" e5 X. L
文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。7 t  c6 O- u! ^5 Y9 V; j$ z
runsong 发表于 2010-7-18 14:35

  A6 d  D5 n. r4 E, v不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

) F* A5 d8 V& q- c1 ]

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。2 [& [& }1 d, t$ P; @
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...
; j& r# v7 d8 a- srunsong 发表于 2010-7-18 14:27

+ Q1 z8 _$ @$ B7 Q, y% L我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。
1 ~5 i  O8 ?+ ]另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

谢谢分享