组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

% b: \! R0 Q6 b, w1 d/ y
/ f0 z4 z) m3 J6 t( W具体步骤：
3 k1 }$ S2 R  Q! T9 y$ N3 L1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟" ^8 W. j$ n" v
2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭
+ R% U! Z! R1 S5 |( {) c) ]3 M  ps.两种都试过，结果没有改善2 f1 E$ q# e; ~2 R: C: |" K$ c0 _
3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）: F, P; U/ ]" u
  4℃湿盒过夜
+ M+ ^4 W; h6 y3 o8 H) d; ~$ @4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min
& r- E* t; [5 M3 w+ l加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光
! y  V- D5 @$ T: _4 _! \5 L# \5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min/ b, Q7 ~9 m. z
6.染核，PBS洗3次，每次5min
3 [, i1 P7 v7 Y7.封片，荧光显微镜下观察, b9 a! R! ^( }- N5 q/ R

1 @. B7 i0 ~- }; R结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。
" h) V. w' H& _4 O0 Z" t; C请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试" s  ^$ ^# f5 s. H; z5 L6 d7 I% H! j
淡定 发表于 2010-7-16 13:05

) O( ~4 R, X$ v3 o6 _, L- N
试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

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你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。! F7 s$ {0 D$ t$ @
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。2 u; {) |& U7 z  Y7 i- U
文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。
( M: X. \" ~( a  z$ ]2 erunsong 发表于 2010-7-18 14:35

6 `" c- o: a9 i# S5 k( H. Y
不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

3 {. q" [5 h3 [6 \

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。5 ]- x* e* ]9 l5 N
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...$ e2 W* c  [0 G2 A
runsong 发表于 2010-7-18 14:27

; B: F0 Y: R. k我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。) F, K. E6 \# d$ R* f0 Z' f( d, p
另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

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