请问有没有用磷酸钙共沉淀进行慢病毒包装 请教大家

lpzhdm

由于lipo2000价格很贵，所以尝试用氯化钙共沉淀的方法来进行慢病毒包装，按照Production and purification of lentiviral vectors （nature protocol, 2006）所讲的方法进行，首先采用明胶coating，PBS洗2遍后，种上已传3代的293FT细胞，进行eGFP慢病毒包装，使用的是四质粒系统，共设计了6.90，6.95，7.0，7.05和7.10五个pH的进行试验，3%的CO2孵箱培养，转染后第二天发现6.90和6.95较其他组亮，效率还可以，就是荧光感觉没有用lipo2000转染时的清晰，24h左右换2%的培养基，10%的CO2孵箱培养。第二天有个别盘细胞漂浮，但我没有当回事，因为lipo2000转染包装时，也会在边角部分有漂浮现象，继续培养约60h，收集病毒上清，刚拿起培养皿，整片细胞即悬浮，胎盘蓝染色，证实细胞已经死亡。
1 w3 ]4 V9 l& t  t5 S4 ~    但所有试剂均按nature protocol所列货号进行购买，调置pH时，为防止污染和毒性物质的参入，我是用等量的两个管，一管调pH，记下调至特定值所需的NaOH添加量，再向另一根管加入等量的NaOH溶液。! q3 Z$ j( E; n
    请大家不吝赐教。

sciencezhu

你好，我做过用氯化钙转染293T细胞包装假病毒，当加入2X HBS时，要确保混匀，室温静置4-5min,然后滴加如刚从培养箱中取出的293T细胞皿中（转染前换液，培养一段时间，确保培养液是温的，或者将培养液在37℃预热，转染前更换），轻轻混匀，显微镜下观察细胞培养液中悬浮着一些细小的颗粒，培养12 小时后要记得换液。

lpzhdm

回复 2# sciencezhu
0 N$ n  O( K2 z8 @0 F* Q谢谢！, ~  z% ?8 I# M( I; A8 s
是不是转染后，12小时必须得换液，不能过太长时间，我换液时已经是25小时了，是不是这样造成细胞损伤过大。

简简单单

我们实验室用过这种方法进行慢病毒包装，效果挺好的。

学习快乐

学习快乐。多谢。

ganxibao11

我们用磷酸钙转染293T包装慢病毒时，转染24小时后， 换掉培液，加入新鲜培液， 收集36小时和72小时的培液作为病毒上清收集液。效果不错， 供参考！

sciencezhu

回复 3# lpzhdm
8 I0 O9 a" r; J" s, ]  h+ G. }; B% R9 E( D1 M4 s' a

/ B; K6 N' ~7 R/ P& i    很有可能，你不妨可以尝试下转染后12h换液，看下转染效率有没提高。另外形成颗粒的大小对转染效率也有直接的影响，要充分混匀，静置的时间也得把握好，长了颗粒会变得很大，效率会很低的。祝你实验成功

lpzhdm

回复 7# sciencezhu ; G3 l. r7 Z# ]" U% M* h
看来我静置的时间也有些过长，估计有半小时。非常感谢

lpzhdm

回复 6# ganxibao11 ) K; k3 {  K, Y6 v, l+ f& b
谢谢

ahfjwangrui

用磷酸钙转染质粒包装病毒,我做过,其实这个很费时,首先要保证细胞状态要好,密度最好在70%左右,不要太密,否则后期细胞会长满漂起来!其次,要关注转染前两小时换液问题,有时候换液后细胞大块漂浮,两小时后很难再贴壁,所以建议适当提前一段时间换液,当然,你的细胞很好,不容易漂浮的化,也最好是2小时换液了;第三点,要配好质粒混悬液,一般6孔板的混悬液总体积200ML,前者100ML的2*HBS,后者100ML包含无菌水,质粒,氯化钙(2M)10UL,两者混合时间半小时,对了,HBS要逐滴加入后者,并不断在需吃气泡混匀;第四,加质粒混悬液到细胞时,需要逐滴加入,并要快速混匀,避免形成大的DNA颗粒.第五,加入质粒混悬液后一般6-8小时需要换液,但根据细胞状态可以适当延长,最好不要超过10小时就行了!最后,病毒在48小时后收集!