饲养层细胞的制备

懵懂干细胞

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。% ]. T% _* ^. I9 B' Q2 F
我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，! ~8 p6 n. N1 p0 T
直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：, ]8 @/ t$ t& A6 ]4 n
（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％ 乙醇浸泡消毒。4 f& Q: `0 V/ c+ U  }
（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。% n0 H; z) w) ]/ b
（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。
/ B# ^9 G1 a& I3 n0 @" y5 p: ^（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。
" H3 S8 d, N' S. E( ~+ F（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。
: h6 n) M2 n- c$ x, s8 I  A+ J（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。
6 L( B& f  Q) }' v（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。
' K# E6 f+ ~" ^6 ]- W2 F/ A# k8 d0 C/ T（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。( |+ t, y9 p( c8 A0 q
（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。) x! I; v3 A, e. U4 m/ {" C
（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。; ~% E! m7 `, p" R; f- i
（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

第一心音

筛网是什么样的啊，谢谢

igdb

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3 }! m$ ]% k& l6 y9 `6 D; q& J" w" B! W
嗯，叫法没关系。。大家别混淆就好

懵懂干细胞

回复 igdb 的帖子
; l0 v* U+ g/ Q/ x, y; L# B
$ D; F# B* g. U是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！ 可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的

igdb

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6 z) u4 F4 y5 c4 H4 j
1 @2 k! D2 {, \' A0 r, K, X第一代不是应记做P0嘛？？

mansnoopy

回复 llecstem 的帖子
3 v8 |: P' |4 \9 ?
0 E+ e1 |# J( K2 H$ ^$ b这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

mansnoopy

回复 zdgrp 的帖子
" g3 |$ y& D* @, g, a- ]$ P6 g! u# R- n
肯定是需要用的

zdgrp

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

懵懂干细胞

回复 llecstem 的帖子: S' ~; m4 c; C* N

* P9 }" z1 d" i4 _+ E这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？
( q6 ~5 G+ {& o; U5 T7 M. g* [复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己% ~1 Z5 d6 B, T
估算一下时间吧。

llecstem

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- l* f. w  K  M8 p' j0 r
& Y  |& U& w6 d, }想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？