饲养层细胞的制备

懵懂干细胞

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。
6 w3 J+ V) m% ~+ y我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，) q6 @2 r) o* A) W/ L; d
直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：6 F1 A$ E: Z6 F$ A" u8 F
（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％ 乙醇浸泡消毒。$ p/ s6 ~$ n3 I' j" u# D
（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。
' b# l1 i4 Z2 t0 K3 V$ x) y5 F（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。
) G! c& o' c* y$ \- b5 f# H, v（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。
- P; ]1 @. l. v+ N# ]+ n7 P（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。8 }8 {1 B" x2 @0 o- a
（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。
4 A  @3 F% d' E% e2 Z; ^& E（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。
# z3 F% {! U; w: e（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。
* E8 |. K- {) O7 D（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。
* R1 _8 ]% U7 l3 y（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。
" d, c' s) U3 K2 e/ M, `3 ~4 L（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

yuhaoze

学习

songyang1987

谢谢分享

llecstem

回复 懵懂干细胞 的帖子7 @) F8 k4 x, W* c* Q3 q
) P3 `* i+ @! \
想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？

懵懂干细胞

回复 llecstem 的帖子
4 m7 n$ c( A/ ~$ ^# Y" n. }7 U: L7 t
这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？
$ G; W% O8 t# I复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己. V2 ?2 k: _# b" x
估算一下时间吧。

zdgrp

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

mansnoopy

回复 zdgrp 的帖子0 U8 n. c2 V3 n/ p
+ }+ @) N7 k5 o3 L( z+ E2 @
肯定是需要用的

mansnoopy

回复 llecstem 的帖子
' o+ {) Y8 K; }8 G7 E: o( v4 }  _: R2 [
这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

igdb

回复 懵懂干细胞 的帖子$ ~) l$ q& s- _. ^$ R
( ~9 m' {& N+ A2 V. x
第一代不是应记做P0嘛？？

懵懂干细胞

回复 igdb 的帖子* z" v- a: Y$ t  B1 ?$ M* t# `
3 w- V- ^( _  t
是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！ 可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的