饲养层细胞的制备

懵懂干细胞

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。& T1 O3 O9 ]' |$ ?( e
我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，
* S5 k) G9 R+ O% S" T! Y# I直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：4 U9 Y" [8 y4 y* z! u* E
（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％ 乙醇浸泡消毒。
8 b9 h* D4 j6 ^: U（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。1 w  D2 y1 G. M$ j
（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。
7 i% V. Z# {4 Z2 R+ S8 R（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。
9 Z% Y: p2 M3 w3 k; X1 z* R7 D* P（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。( y) X; l/ R5 x; K# S9 K( ~
（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。
2 P3 j! q* ?/ T% O0 O* C（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。
$ y& H& ]7 Y0 v1 R( }" E& K（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。
7 l8 E9 O3 E( ]7 z3 e5 |（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。. W! a( a: A8 Z% i7 D% A
（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。
0 [  M, @% _% `! C4 z! l( r. {（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

yuhaoze

学习

songyang1987

谢谢分享

llecstem

回复 懵懂干细胞 的帖子* C; S4 ?' ]$ T/ q5 `( L

( A  {7 w( y; E: x! s! ?想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？

懵懂干细胞

回复 llecstem 的帖子8 U" Y1 S1 h- A; G# q

0 U8 A3 r- b% U6 _' {4 V/ l这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？
/ _+ ]. e% h8 M0 n, {  B: P) b复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己3 c( N8 r" }+ }. x) I
估算一下时间吧。

zdgrp

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

mansnoopy

回复 zdgrp 的帖子
- U  b9 z1 i; B5 B3 }$ s
, Y1 q4 E9 l& i# r肯定是需要用的

mansnoopy

回复 llecstem 的帖子
; T* Z. J% e" g$ q0 K) u$ U/ X
% W& L# y) o2 g( r! n% n这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

igdb

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1 b; n$ i4 Y1 B& D+ J1 v  x: O, s+ W: A4 k
第一代不是应记做P0嘛？？

懵懂干细胞

回复 igdb 的帖子5 n0 R2 ?$ }3 N& I

+ n& e3 b% T; u% Q5 A1 ^是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！ 可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的