请教iPS诱导过程中的问题（有图）

上官鑫

请教各位高手如下问题：（1）mouse fibroblast 诱导过程中，细胞形态会发生变化，慢慢变圆，如图，但是最终不能产生iPS，几次都是这样，而且feeder变的很差。( ]8 R( J6 U. ~, K5 v
（2）Feeder和media养ES没有问题，如图，但是把诱导后的Mouse fibroblast铺到feeder上，换成养ES的培养基，Feeder不到2天就变的很差很差，不知为何？还望各位高人指点。

懵懂干细胞

关注中！

mbjane

关注ing

manybit

严重关注，非常有趣，干细胞培养会集中吗？

chengrui

你在诱导过程中使用的病毒可能滴度不够高，也能导致这种细胞形态发生变化，但不能产生完全iPS细胞的现象

shewawa

方便说下fibroblast 的cell line吗？这个是用什么诱导的iPScells？病毒吗？什么病毒作载体啊，还有诱导的时候用了几个factors，三个还是四个。用的transfection的试剂是什么？做病毒的细胞是什么？有没有放其他的东东。上面说的你都要注意的。
0 f! m& k: P) Y$ t' x' u2 z在generation of iPScell 的时候，那个virus titer 是很重要的，你有没有进行检测？ 这个我在第一次做的时候也出现了这个样子的细胞，我们成为PRE-iPS（你的那个可能还没有达到这个程度）， 这样的细胞会具备iPS的很多阳性指标，但是me-3k27可能是阳性，还有没有development的能力，也很难进行expand。你下次如果再做的时候要想办法提高 virus titer。5 a( L, W/ ?3 V' {1 k$ s9 j
那张图是day10你别急，也可能出现iPS,mouse- iPS （4 factors）十四天会出现 iPS cell的。3 factors更长时间。

shewawa

顺便说下，你的ES细胞培养的真漂亮。看来技术很不错:)

上官鑫

用的自己取的原代MEF，然后传代到第4代左右用于诱导。包装病毒用的293T，我也想用高级点的包装细胞，但是这个实验室没有，而且用的钙磷瞬时转染。pMXs经典的O，S，C，K诱导。那个ES只是随便养养，想检测一下我的media和feeder有没有问题，这里有趣的事情就发生了，media和feeder养ES没有问题，但是用来养induced MEF，不到2天feeder就变的极差，我也怀疑是不是引入的induced MEF被污染了，但是除了feeder基本上死光光了，induced MEF又能长起来。很奇怪。shewawa说的很对，这些变化的细胞挑克隆根本就expand不了。

cicadacjk

我觉得问题基本可以圈定以下几个：$ Y5 M5 r/ ~0 T
1. 你的293或者MEF有支原体污染，feeder变差就是这个原因，支原体存在基本上是做不出iPS的，必须除去（这个应该是主要原因，其他两个是附加建议）% Q) f. a) K1 C6 g3 R) z. J/ S: O( C
2. 你用的MEF代数太老了，一般三代以内，P2更好。
( {* a/ l; o( `. ?; }- f3. PMX诱导，你附加了什么包装质粒，如果滴度高，六天四因子感染的MEF会长得满盘都是，所以包装质粒，转染技术可能都要提升。

上官鑫

但是如果有支原体污染，为什么induced－MEF又能长的很好呢？是因为它比feeder抵抗力强吗？其实用普通的media养没有问题，一换成ES media养，feeder就很快死翘翘了。我怀疑是media有问题，就用它养了一下ES，结果ES又能长好。其实我也觉得是支原体污染，因为ES media有20%的血清，正适合支原体生长，是不是降到15%会好些？其实我还怀疑pH的问题，那个ES media配出来就是接近黄色的。
7 @% l2 j' s( ?5 c$ u8 O   关于代数问题，P4还好啊，以后还要诱导人的，那个都是10代左右了，前途渺茫啊。9 w! P2 Q" V; l( {$ C; ^/ ]" s
   pUMVC和pCMV－VSVG包装，加上目的质粒，3质粒共转，那个pUMVC是low copy，不好用。