求助：骨髓间充质干细胞复苏

yaqingqing

我养的是大鼠骨髓间充质干细胞，P3冻存，复苏至T75 flask中，可是复苏后的细胞都3天了，贴壁的特别的少，很多细胞都悬浮着，不知道怎么回事。& Y+ Q" F$ M, @' f) ?0 p1 d! W* I
请各位高手帮帮忙！！

luoziwei

悬浮的基本都是死细胞，所以可能是冻存的效果不好吧

zx19851985

复苏率低，冻存的时候有问题吧，冻存液配制不佳？复苏快融，融的时间太长了？复苏后24小时换液没？换次液再看看，还有你的培养基没问题吧

皮搋子

细胞冻存与复苏：- [3 Y. ]% N! J0 j' B- n
      冻存：选择细胞状态最好时冻存，冻存液10%DMSO，30%血清，60%培养液，最好是配好了放于4度，待温度降为4度后再用于重悬细胞。而后用包布包好，放于-20冰箱2h，再-80过夜，从包布中取出放于液氮中。
4 r5 K. j  B7 y5 i* f0 y      这样能够保证细胞有较高的存活率。
+ J) o4 ]9 B" p3 q      复苏：准备好37-40度水浴，将细胞从液氮中取出，迅速置于水浴中不断晃动，待全部融化后取出，准备一支离心管加2-3ml培养液，将细胞加入混匀后1000rpm离心5min，弃上清，完全培养液重悬。
: a' j6 O' q$ `# i3 g0 B     这样操作对复苏细胞来说条件比较温和。
; m8 Y8 k2 ~, R: L      如果你复苏的操作没问题，那问题一定是出在冻存上。不过有时候也会出现这样的怪现象，一批冻存的细胞有的复苏效果就很好，有的就像你说的不贴壁。不贴壁的问题应该是出现在瓶子上，可能是这个不好的瓶子就被你赶上了！6 A1 V7 v& Y4 E1 e& P$ v  F
      建议你在复苏一支试试，如果在正确的操作下还是不贴壁，这一批细胞很可能就都不能用了。

痞子的烟头

上面已经说的很清楚了，注意血清与DMSO加的顺序

yaqingqing

回复 3# zx19851985 ! k# J+ t* i- m

# a% o: `' C% G- D    谢谢你的关注！！1 r- ^& P- {$ s. G0 v4 e& N% |
    冻存液我是按我们实验室的基本经验DMSO:完全培养基=1:9配制的。融化时间不超过60s的。复苏后24小时后我观察贴壁细胞较少，就没有换液，想等等看的。

yaqingqing

回复 4# 皮搋子 ' D% X9 V6 z: k

% I. s1 y; K+ o8 Z- J  {: s5 v" p! P
) H" I& i; g4 w7 c  K3 L    非常感谢你的建议！！# T, K0 y1 p. E# D0 q
    我现在隐约觉得可能是我复苏时的细胞浓度太低而对他的生长有影响，但不确定。所以我会再复苏一支。

yaqingqing

回复 5# 痞子的烟头 9 \! t! ~6 t/ }3 W  o( z
! C* n- F% C6 a& ]9 A
3 O' t4 D4 e1 E& t3 i4 H6 W
    感谢你的回复！！9 m* D( g) o2 `/ \" x+ e7 d* `
    我想请问这个血清和DMSO添加一定要有顺序吗？如果有，应该是怎样的顺序呢？
7 |$ a$ O; E( z& E( l    谢谢！！

若兰汀

# h4 z, [5 Z/ `# z5 V/ E0 o! @% o$ D8 H6 o
悬浮的细胞不一定是死亡细胞，也可能是老化了，死亡的细胞一般会固缩变暗，老化的还是会透亮。请问冻存细胞前细胞的活力怎么样呢？首先冻存前细胞的活力得保障，一般选用铺板率90%就好了，不要太过稀疏或是浓密；然后冻存的时候可适量多加点血清保证足够的营养环境（20%-25%均可），冻存时尽量避免震动冻存管，因为此时细胞内有冰晶形成，轻微的震动都有可能造成很大的细胞损伤；解冻时要迅速，我一般是30-45s，因为冻存液在常温下对细胞是有毒的。复苏的细胞培养液血清含量适量增加，15%-20%均可。还有冻存时保证每管的细胞浓度不能太低，否则复苏后的细胞确实长得很慢。

若兰汀

悬浮的细胞不一定是死亡细胞，也可能是老化了，死亡的细胞一般会固缩变暗，老化的还是会透亮。请问冻存细胞前细胞的活力怎么样呢？首先冻存前细胞的活力得保障，一般选用铺板率90%就好了，不要太过稀疏或是浓密；然后冻存的时候可适量多加点血清保证足够的营养环境（20%-25%均可），冻存时尽量避免震动冻存管，因为此时细胞内有冰晶形成，轻微的震动都有可能造成很大的细胞损伤；解冻时要迅速，我一般是30-45s，因为冻存液在常温下对细胞是有毒的。复苏的细胞培养液血清含量适量增加，15%-20%均可。还有冻存时保证美观的细胞浓度不能太低，否则复苏后的细胞确实长得很慢。