求助小鼠骨髓间充质干细胞几个问题（附图）

feifei105

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本人采用全骨髓贴壁法分离3只小鼠胫骨和股骨，用1ml注射器吸取L-DMEM 10%FBS培养基将骨髓冲洗出来，还用血管钳夹碎骨骺端，1000rpm 5分钟后至12孔板2个孔。3天后首次全量换液，至第5天仍不见贴壁变形的细胞，可能的原因？1. 我由于手法问题，将骨髓冲出时发现有些已凝结，但又尽量将血状絮状物冲碎，我园子里有人这么做也分到好些细胞，不知道这个是不是关键？2. 由于培养液的原因导致细胞贴壁不好（我用的进口血清）？
" T- R) M" B, ?$ C' v下面图是第五天的细胞，没有贴壁变形的细胞，请教这些大的圆形细胞（不是血细胞）是什么细胞，我刚取分完时在显微镜下看也都是这种细胞（除了血细胞），只是密度很大而已，所以请各位高手帮帮忙，急死了。8 Y, S+ E- r" h6 l- Q! r
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还有一问题想请教：我只追求细胞纯度，想采用Percoll是用1.073g/ml吗？我看有人用1.082g/ml,哪个更好，密度梯度离心适合分离小鼠BMSC吗？用全骨髓培养的BMSC纯度如何？
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若兰汀

我说一下自己的经验，希望对你有帮助。1.老鼠的选取，我用4-6周龄Balb/c雌鼠，c57的细胞活力比Balb/c的强；2.老鼠断颈处死在酒精中浸泡5-7分钟，无菌分离双侧股骨和胫骨，我采用剪掉骨端的骨骺避免有碎的骨渣，1ml注射器吸取DMEM：F12完全培养基冲洗骨髓腔至骨头发白，冲洗的时候最好在培养皿上放一张尼龙膜可以滤过凝固的骨髓块。3.培养基为DMEM：F12+10%FBS；4. 24小时后全量或半量换液；以后2-3天换一次液，小鼠MSC细胞要传4-5代才能尽可能去除杂细胞。你需要保证纯度首先要保证细胞量要大，不然细胞很难贴壁很难养，分离的时候要保证无菌快速否则肯定会凝血凝骨髓。我有同学分离肺部内皮细胞，他在分离前把肝素钠注射到老鼠体内这样避免凝血，你可以试试。祝好运

athena1988620

我做的大鼠是48小时换液，7天左右才有贴壁的，现在长得还不错 你再等几天看看

lele

我遇到过这种情况，后来查出是血清的原因，换了批血清就好了

fengxuan

我 首次加20%血清促进贴壁，以后添加10% 血清，有细胞贴壁

郝晓英

回复 飞翔的十字架 的帖子- K3 a% `, r# a: S6 D: E

9 Q1 T( m- m( ]4 o1 p' u你好 我现在也在养SD大鼠骨髓MSC' a5 M. ~: F6 H2 a$ m4 U
方便加我QQ吧：847508395  注一下：MSC啊  呵呵
/ F* J6 C1 L7 l: U* u! L7 h6 Y可以讨论一下啊

bathpp2007

我也是刚上手，用全骨髓培养。结果还可以。我觉得离心不用太久，我是700r2min。去上清后重悬，多吹打一下，一定要吹打开。接种之后还是能看到很多血细胞，但是24小时换液后未贴壁细胞就几乎消失了。换液的时候我用pbs吹打了两次，每次大概15遍，我觉得间充质细胞24小时可以贴壁的很好了，所以不用担心吹走

漫游天龙八部

1，建议可以在培养液中加入细胞因子，我开始培养兔间充质干细胞也遇到这种情况，到现在还不知道是什么原因。后来研究室的老师建议下加了因子，解决了,2，凝血可能影响细胞，我在 抽取兔骨髓时，将注射器内加入1000单位肝素。
  M( t) s( W* P' R/ H: U个人意见，仅供参考。

cheese

会不会是细胞密度太高了，血细胞太多影响细胞贴壁，而且，细胞密度太高也会产生很多代谢废物啊

cheese

回复 daviddow 的帖子; P7 L0 f% V7 `$ b4 T) s8 o
- F' q2 A  O3 ~. e5 z; @1 w1 T
血清如果换2%会不会太低啊？