求助小鼠骨髓间充质干细胞几个问题（附图）

feifei105

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本人采用全骨髓贴壁法分离3只小鼠胫骨和股骨，用1ml注射器吸取L-DMEM 10%FBS培养基将骨髓冲洗出来，还用血管钳夹碎骨骺端，1000rpm 5分钟后至12孔板2个孔。3天后首次全量换液，至第5天仍不见贴壁变形的细胞，可能的原因？1. 我由于手法问题，将骨髓冲出时发现有些已凝结，但又尽量将血状絮状物冲碎，我园子里有人这么做也分到好些细胞，不知道这个是不是关键？2. 由于培养液的原因导致细胞贴壁不好（我用的进口血清）？2 |( t2 ^) S& e; f3 E. b
下面图是第五天的细胞，没有贴壁变形的细胞，请教这些大的圆形细胞（不是血细胞）是什么细胞，我刚取分完时在显微镜下看也都是这种细胞（除了血细胞），只是密度很大而已，所以请各位高手帮帮忙，急死了。% v1 j; V8 {8 F% i7 a
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还有一问题想请教：我只追求细胞纯度，想采用Percoll是用1.073g/ml吗？我看有人用1.082g/ml,哪个更好，密度梯度离心适合分离小鼠BMSC吗？用全骨髓培养的BMSC纯度如何？
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飞翔的十字架

3天后全量换液有点晚，血细胞虽然不贴壁，但是会沉降! c1 \6 [# o! u( g/ y
我觉得最晚24小时换液

飞翔的十字架

我最近大鼠MSC养的也不好，不管percoll还是全骨髓
6 X0 w0 ?5 t5 U9 P& s! |% r现在正在尝试protocol说的3h换液 以后8h换液直到3d
0 W1 y$ Y) b% v  a) l* j理论上说 贴壁细胞2h肯定能贴壁啦 不过换液要很小心) l$ ?3 @! j: h1 z+ {, x. L  _
下午再尝试下离心的 我用的大鼠是1.073

suning

首先，细胞没吹打散。仍有些许细胞聚集。若有血细胞建议裂解，用无菌水几秒即可。大园细胞可能是一些粒细胞吧

daviddow

你用DF12代替那个L-DMEM试试。
* i! B  H+ H4 g/ S1 S血清换成2%。

267318024

我同学用全骨髓培养法养老鼠的BMSCs养的很好呢，24小时半定量换液，然后隔天换液，用PBS液冲洗，细胞培养出来，都开始传代了，你用淋巴细胞分离液，个人觉得不好，干细胞数量本来就少，还分离了再取，又会损失一部分了，并且培养的环境也破坏了。

feifei105

回复 5# daviddow
1 ~+ B( R5 H. t- `  _# J! B3 D! Y1 {3 L8 s8 [) j0 v4 H

0 ~1 Y2 ~% G* b0 L5 R; M( z9 v7 @    2%血清可以吗？不会由于营养不够长得不好吗？

feifei105

我觉得这些大的细胞是中性粒细胞之类的，随着换液就都换走了，可为啥没有我的骨髓干呢？是不是有些凝血的原因？

feifei105

回复 2# 飞翔的十字架 5 y* ?+ L& n7 t' L6 k8 l  {6 P* e
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5 H1 N1 Z; R5 o" Y+ w5 u    谢谢，我试试

feifei105

回复 6# 267318024
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( t# U7 s- ^- P- }& q0 `2 E2 h; ~9 g    非常感谢，可是我没有贴壁的细胞，是什么原因呢？血凝的原因？