请教做feeder细胞

lorey

刚开始学习做feeder，总是出现下面几个问题：
  _9 V6 u& J, O$ [% j4 T8 ~; B) f1、细胞消化后，特别粘稠，组织块不沉淀（加DNaseI没什么作用）
1 ~! D! o. y. s/ ^2、勉强取上清，但是离心后沉淀总是漂浮的9 A. G, c9 T& J; M' U
3、铺好的细胞，总是成团生长1 T4 y; R: b5 U8 x

, s) X$ Z" j1 m& @! R- k& F- b各位大侠，怎么解决呢？
* M2 h7 M6 X: [' ~7 \另：各位做feeder时，去头尾四肢内脏后消化多长时间？

iseeyou1210

we do 3 rounds of trypsinization and for each time 3 min (mix in between).
2 l$ P8 y+ f% Q; S: J5 K4 uI used up to 1500rmp (around 500G here) to pellet the cells." t7 H/ y$ e2 O) b
I never remove the head, tail....

如来的观音

楼上的回答不一般啊，佩服

如来的观音

楼上的回答不一般啊，佩服

cony

1，消化完加完全培养基中止时的确会出现一团粘粘的东西，我的做法是用力甩，甩均匀了放一会，等没完全消化的大组织沉下去后再过筛。
3 r+ Y0 t) P2 _/ R; ~  J/ Z2，如将细胞过筛，不会出现难取上清的问题，存在组织块悬浮等问题。6 O# u! P! f8 d5 {- X& x: I1 I! G
3成团生长是因为你连组织块一起培养了吧，尝试消化久一点，尽量消化成糜状0 n  u4 Q1 {+ P. o3 _9 M
4，我一般是剪碎后开始消化30MIN，如果组织块还比较明显，再消化一会，直至大量成糜状
' [" M& r- N- z1 ]/ R: g8 ~8 s3 l% e$ p
以上是本人的做法，一般一只孕鼠最少可得90%汇合以上的第二代MEF12个10CM大板。

fespysok

你做的似乎组织块很大啊，问题可能在于你剪的不够碎。我刚做的MEF提取，将去四肢及内脏的胚胎剪碎1000次，之后加入16ml的胰酶消化10min，虽然也出现了胶状物质，但是不多，弃去胶状物质，离心后沉淀还是蛮多的，都是分离的单细胞，贴壁后也没有抱团的样子。

上海过客

我感觉是吹打的不够 。  用剪口的枪头  充分吹打。 DNA  比较粘，但是断裂了就不粘了 。- j7 V- w9 F1 a( ?

: V- C% N9 C' j% b+ {关键是吹打 不够充分 。  我觉得

iseeyou1210

one more comment, for the cutting the tissue, I always put the embryos insides the 1ml of round bottom cyro-tube and use fine scissors to cut either 100 times or 1min together with 1ml of 1xpbs. the 3 rounds of tyrpsin with 2ml of trypsin in 37 degree (mix 2 times between gently) were performed. inbetween each round of trypsinization, transfer the  supernatant to the tube containing the full medium with FCS.# M9 v! ?$ {" c: W3 T( ^3 q
then pellet the cell ........