请教做feeder细胞

lorey

刚开始学习做feeder，总是出现下面几个问题：
7 K3 ?: ?; D6 {0 s; f" A6 B4 f1、细胞消化后，特别粘稠，组织块不沉淀（加DNaseI没什么作用）
% E, P1 l  ^, G8 L2、勉强取上清，但是离心后沉淀总是漂浮的$ k' m4 v. R8 U' e& l3 |# `- W
3、铺好的细胞，总是成团生长; a5 i, |: h0 f7 b& }
/ C# \2 T" i) S: S; N/ ^: i) R
各位大侠，怎么解决呢？1 _6 a+ Z2 i8 _+ }2 s% W
另：各位做feeder时，去头尾四肢内脏后消化多长时间？

iseeyou1210

we do 3 rounds of trypsinization and for each time 3 min (mix in between).
" ]# Y/ O. t5 B# fI used up to 1500rmp (around 500G here) to pellet the cells.
3 H. G8 A, H. L( A  w  x$ kI never remove the head, tail....

如来的观音

楼上的回答不一般啊，佩服

如来的观音

楼上的回答不一般啊，佩服

cony

1，消化完加完全培养基中止时的确会出现一团粘粘的东西，我的做法是用力甩，甩均匀了放一会，等没完全消化的大组织沉下去后再过筛。
9 |' S3 y0 t/ ]2 k: ^0 O7 t2，如将细胞过筛，不会出现难取上清的问题，存在组织块悬浮等问题。
: z6 p5 x. z7 I7 N3成团生长是因为你连组织块一起培养了吧，尝试消化久一点，尽量消化成糜状+ w8 {: }0 O" u; h' N, l
4，我一般是剪碎后开始消化30MIN，如果组织块还比较明显，再消化一会，直至大量成糜状
2 E, u4 I5 r4 ~
7 w9 G/ @: B8 l/ Z( T1 ?, ~- x7 l以上是本人的做法，一般一只孕鼠最少可得90%汇合以上的第二代MEF12个10CM大板。

fespysok

你做的似乎组织块很大啊，问题可能在于你剪的不够碎。我刚做的MEF提取，将去四肢及内脏的胚胎剪碎1000次，之后加入16ml的胰酶消化10min，虽然也出现了胶状物质，但是不多，弃去胶状物质，离心后沉淀还是蛮多的，都是分离的单细胞，贴壁后也没有抱团的样子。

上海过客

我感觉是吹打的不够 。  用剪口的枪头  充分吹打。 DNA  比较粘，但是断裂了就不粘了 。' I7 j. K/ F& S% K. j9 @
9 z  ?( c( v: p* X6 E: i3 y( p
关键是吹打 不够充分 。  我觉得

iseeyou1210

one more comment, for the cutting the tissue, I always put the embryos insides the 1ml of round bottom cyro-tube and use fine scissors to cut either 100 times or 1min together with 1ml of 1xpbs. the 3 rounds of tyrpsin with 2ml of trypsin in 37 degree (mix 2 times between gently) were performed. inbetween each round of trypsinization, transfer the  supernatant to the tube containing the full medium with FCS.
4 {7 L6 G5 C7 x. D8 J3 i2 Mthen pellet the cell ........