染色专题汇总——冀望集大家之力整合现行所有染色剂，从细胞到分子，从配方到原理~ - 实验室综合讨论区干细胞之家

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17楼

发表于 2010-11-23 08:25 |只看该作者

本帖最后由 deron 于 2010-11-23 08:27 编辑
9 G0 [4 s8 { |. V& h D5 x
苏木精——主要用于细胞核染色
版权很大部分来自于“中山大学医学院病理学教研室凌启波”0 h9 s+ r0 ]" N; @) s. S& Z
一、苏木精的性质; J5 x4 P* O& I7 B/ [) y4 a. D4 w
苏木精，又称苏木素，苏木色精（Hematoxylin）,C16H4O6，分子量302.288。无色或淡灰黄色粉末，市售有无水和含3H2O两种；易溶于乙醇、乙二醇和甘油，微溶于水；本身不是一种染料，没有染色性能，经过氧化和媒染后，才成为一种很好的细胞核染料。
苏木精不是一种活性物质，从分子结构上，苏木精没有发色团，所以没有染色能力。但其溶液放置后，由于氧化作用形成苏木红（hematein），才成为一种染料。
醌型苯环是一个发色团，这样，在苏木红的分子结构中，原有助色团羟基，又有了发色团醌型苯环。5 d" h# m1 k# F! M! Y4 Y1 I2 l

- K/ v" }7 J3 a
二、苏木精的氧化
苏木精的氧化有两种方式：) Q$ {: \7 y5 z/ i; Y- Y. l
1.自然氧化：通过空气和阳光的作用而被自然氧化成苏木红，过程数周至数月。这种染液的保存和使用寿命较长。
2. 人工氧化：配制染液时加入一定量的氧化剂如氧化汞、碘酸钠、高锰酸钾或过氧化氢等可立即使苏木精氧化成苏木红。但要注意加入氧化剂过量时会造成氧化过度，破坏了苏木红的分子结构，导致苏木精液的染色力减弱甚至失效。 9 Z1 J9 a; z3 c+ d5 m
成熟的苏木精染液是苏木精、苏木红、苏木红的活性氧化产物和非活性的超氧化产物的混合物。
早期传统用氧化1g苏木精所需氧化剂的量是：氧化汞 500mg 、碘酸钠 200mg 、高锰酸钾 177mg 、过氧化氢 2ml，但问题是染液使用寿命不长。5 E$ T2 A& G" m* a7 r( G+ C3 N. Y
近年有学者提出用较少量的氧化剂来配制苏木精染液，其染色效果亦佳，苏木精染液的使用寿命延长。他们推荐1g 苏木精所需氧化剂的量是：氧化汞 100mg、碘酸钠 40~100mg、高锰酸钾 90mg 、高碘酸钠35mg、碘 200mg 、高碘酸钾 50mg
理论上，1g苏木精•3H2O完全氧化成苏木红需用碘酸钠185mg，而1g无水苏木精完全氧化则需用碘酸钠218.2mg。Gill提出半氧化苏木精法，即氧化1g苏木精仅用碘酸钠100mg，这样先使部分苏木精氧化成苏木红，未被氧化的苏木精在随后的日常染色操作中慢慢氧化成苏木红。这样，染液既不会过染，又经常有新的苏木红形成补充，苏木精染液的使用寿命就可延长。
苏木精的氧化与下列因素有关：
1.苏木精染液PH值。染液偏碱性氧化快，中性时稍慢，酸性时很慢，所以加酸时的苏木精染液可延缓氧化。
2.氧化剂的量。加入人工氧化剂后苏木精可立即被氧化成熟可用，自然氧化和供氧量有关。如靠近阳光、染液通风、经常摇动等可加速氧化。
3.氧化时苏木精液的温度。用碘酸钠等作氧化剂时，在常温下加入即可，而用氧化汞作氧化剂时，需把苏木精液煮沸时加入才能放氧。
三、苏木精的媒染" x3 i1 {" _) J5 E8 h- T- Q* r' s2 |
苏木精被氧化成苏木红，苏木红为弱酸性，呈红色，对组织的亲和力很小，用单纯的苏木红液染组织，和一般酸性染料一样呈弥漫性染色，且染色浅淡。但当加入某些物质如二价或三价的金属盐如铝、铁盐后，染料分子就能与这些金属盐的离子结合形成色淀（lake），这种色淀具有阳电荷，能与特定的组织成份牢固结合。这些二价或三价的金属盐就称为媒染剂（mordant）。用作媒染剂的多是二价或三价的金属盐如铝、铁盐，也有采用碘、钨、钼、锂、铅和铬等。' y) P( f) p2 {# j
常用的媒染剂有：
硫酸铝钾又称钾明矾 K2SO4 • Al2(SO4)3 • 24H2O  % S9 }% w1 c! f3 z/ M! w5 z
   硫酸铝铵又称铵明矾  （NH4）2SO4 • Al2(SO4)3 • 24H2O 0 }4 H" @+ z: O
   硫酸铁铵又称铁明矾  （NH4）2SO4 • Fe2(SO4)3 • 24H2O ) K8 [1 o9 g! s  K' K& n7 P
   硫酸铝             Al2(SO4)3 • 18H2O，
三氯化铁          FeCl3 • 6H2O1 b9 @: ~3 a% P* d
苏木红和这些金属盐结合形成蓝紫色或者蓝黑色的色淀，这些色淀和胞核结合得很牢固，用水或乙醇均难以洗脱，Weigert铁苏木精染液更可以作为耐受酸性分化和用较强酸性染料复染的首选胞核染料。
从苏木红的结构式看，原有助色团羟基，又有了发色团醌型苯环，应属一种酸性染料，但由于酸性助色团羟基的酸性很弱，对组织的亲和力较小。加入媒染剂铝盐后，铝盐与苏木红螯合形成蓝紫色的铝-苏木红色淀，该色淀呈强盐基性，带正电荷，作用相当于碱性染料，即带正电荷的蓝紫色色淀和带负电荷的胞核脱氧核糖核酸磷酸基进口极性吸着而完成染色。

4 `% H, z% `8 w" f% K% K, d; K( F7 y- [
四、各成分作用' ~/ k% ]3 h, z* n
1.氧化汞、碘酸钠：作为苏木精的氧化剂，使无染色力的苏木精氧化后转变成有染色力的苏木红。6 p8 {2 n+ P0 y' t& Q
2.硫酸铝钾、硫酸铝铵和硫酸铝：作为媒染剂，其三价铝离子与苏木红结合形成蓝紫色的色淀与细胞核内核酸的磷酸基牢固结合。
3.无水乙醇：较快溶解苏木精，并可抑制霉菌生长。
4.乙二醇：也能较快溶解苏木精，抑制霉菌生长，其沸点高（b.p.197.2℃），苏木精液不易挥发。
5. 甘油：作为稳定剂，延缓苏木精染液蒸发，防止苏木精过度氧化，延长苏木精液的使用期。" r& n, I2 S: f9 B1 I$ P
6. 冰醋酸：可抵销氧化剂的氧化，使苏木精和苏木红保持均衡。同时又可增加胞核的选择性染色，使胞核染色质显示得清晰细致。: ?/ C$ a) X: X" N/ P4 A
7.柠檬酸：作用和冰醋酸相同，加入柠檬酸1g，相当于冰醋酸20ml。
8.水合氯醛：起保护剂作用。
五、简单介绍一种配制——鄂征的改良Mayer法
0.5g苏木精，5.0g铵矾或者钾矾，0.1g碘酸钠加温溶于70ml蒸馏水。再加入30ml甘油，2ml冰醋酸。混匀过滤后为母液，用蒸馏水按1:20稀释即成工作液。

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16楼

发表于 2010-11-23 08:09 |只看该作者

接下来本应该是HE染色，该染色可分解成为苏木精染色+伊红染色，所以在HE之前，我们先了解一下苏木精染色、伊红染色，顺便再补充一下前面提到的美蓝和天青。

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15楼

发表于 2010-11-20 20:41 |只看该作者

吉姆萨染色——瑞氏染色他弟

染液组分1 p6 ?/ {4 A6 h- X$ F1 U s8 A, W* w
吉姆萨染液由天青，伊红组成。 P! E) {. ]; P1 B6 O2 Q& k6 x! ]1 D9 ~

染色原理
嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；
细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；
中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。* a( ^' s( Z$ N" D& L; N
$ \% n! @! L* m0 L5 F$ t
染液配制
配方一：1 o. P; i) ]) n% O9 \
1. 取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油中，置于60℃温箱，约3h后溶解。
2. 取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶中长期保存。5 n+ G- C5 ^# c/ F. C. i: H
3. 母液与0.1mol/L的PBS（pH6.9~7.2）按1:9混合即成工作液。工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。
配方二：
1. 吉姆萨干粉1.5g，甘油（分析纯）50ml，甲醇（分析纯）50ml。配时先将Giemsa干粉倒入研钵内，加进少量甘油，仔细研磨约半小时，至无颗粒状为止。
2. 把剩余甘油全部倒入研钵内磨匀，然后装入棕色试瓶中，置约60℃温箱中保温2小时，再加入甲醇，混匀后贮存备用。( k& [" o# a, G1 C$ A0 d9 d; J
3. 同配方一。
配方三：) L* c: b6 N. }) S
在没有优良吉姆萨染料时可以采用：天青Ⅱ一曙红盐3.0g, 天青Ⅱ0.8g，甘油250ml，甲醇250ml。配时取天青Ⅱ一曙红盐和天青Ⅱ结晶置于干燥器中充分干燥后倒入研钵中加甘油充分研磨，再加入甘油和甲醇，后续过程同配方二。
% r; j2 i! \; M" S$ N# \( A. k
染色程序
1．标本用甲醇固定5~10min。
2．吉姆萨染色10~15min——可用染色缸或者染液滴覆于标本。& R% l) z4 Y/ y: R
3．自来水冲洗掉红色背景。
& J9 Z- P; }0 o6 W
注意事项
PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均含蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用片必须清洁，无酸碱污染。配制染液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常。

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14楼

发表于 2010-11-20 20:37 |只看该作者

接下来介绍吉姆萨染色，论辈分吉姆萨应该是瑞氏他弟，因为吉姆萨的组成为伊红、天青，瑞氏为依红、美蓝，而天青正是美蓝的氧化产物。' L* J) `) I ~* q! U$ X: l
比较让人不解的是，吉姆萨比瑞氏要来的娇弱一些，它的工作液为了防止二氧化碳酸化，需要现用现配。瑞氏却是在瓶中放置时间越久越好用，不知道坛子里的大虾们有没有能够解释为啥美蓝不怕酸化的。

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13楼

发表于 2010-11-20 09:45 |只看该作者

多谢yuhaoze、jhu132llh、lipd09@mails几位版友的资料，整理结束后我会把完整版给大家传一份。

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12楼

发表于 2010-11-19 21:39 |只看该作者

碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。
以ALP为目标物的检测方法：  , _% z9 A1 h1 l1 _. M
1 Gomori钙钴法  + v: S$ F' \  Z( F2 w# s
【染色原理】
ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】
3%β-甘油磷酸钠5ml  : Q, x; `: X: W0 A, ^
2%巴比妥钠5ml  ; d8 m$ U: i2 e! e/ ^" D; t: u* b
蒸馏水10ml
2% CaCl2 10ml
2% MgSO4 1ml
【步骤】  , T1 d; X# P8 F# W1 @0 v( _
（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。
（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。
（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。  0 }& x! L9 R: x5 H5 ]
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。  / w' u6 T; @' O+ O3 |/ r0 h/ B

2 偶氮偶联法：  % v, R$ O5 b9 v; [
【孵育液配制】 3 @( D* \9 I. t. \
萘酚AS-BI磷酸盐 20mg
DMSO 0.5ml
0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2） 50ml
六偶氮副品红0.5ml  % B# B4 u1 R" \" `7 M, Z
1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。  0 [6 i1 R7 ~: L  g! i1 n  s5 ?
（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）  ' S( L9 Z+ I4 }. e0 i
【步骤】  ! g/ W* Y, J0 i* R: w+ `. C& w
（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。
（2）蒸馏水冲洗。
（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。  ' f7 J# r9 U) A6 o6 ?0 }
（4）流水冲洗，晾干。
（5）甘油明胶封固。
【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。  % v# C; r$ R, ~* o" z0 V
  @  |7 F- y+ i  w+ y7 j
3 碱性磷酸酶染色试剂盒法：  5 k' i1 r: K7 j" j9 H' e
【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。  2 H. O1 Z1 [' p
【作用液配制】
取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。  5 I& S4 T5 h2 z( d8 ]; O" D
【步骤】
（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。
（2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。  7 u6 {4 a0 Z5 O. V/ U1 i
（3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。  4 S4 N- u7 ^% `- w& a% i) q4 `
【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。  1 h. f2 r% a3 y3 q! G

* ~( D( W) k/ C! o% c
针对钙沉积物“钙结节”的染色方法：  % P5 y; R+ d# M+ W9 d: V

4 茜素红法
【作用原理】利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。  # K7 U, g) J, _5 ^% b( g" r: z
【步骤】
（1）培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。  6 Z) W, T+ U; ?( J  i1 n% ~
（2）0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。  # J3 P; g6 ]6 [) J5 Z/ n
（3）蒸馏水冲洗，干燥，封片。
【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。

5 von Kossa法  9 s9 ]$ \  f/ P4 K& _. f
【作用原理】  7 \) `& S1 g% ]  E# S3 f- p
Von Kossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。  ! V1 W2 ?0 ]# a! p
【步骤】
（1）培养皿用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。  3 k* f& J$ \+ y: ~  F$ h9 S% v  ]: C2 O
（2）培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。
（3）倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。  / U, s0 Z. a0 W) z" J6 w* m
（4）培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。  # g1 A" N0 \. P( {2 u  J/ x
（5）室温下晾干，封固。

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11楼

发表于 2010-11-19 20:27 |只看该作者

整理资料很累，大家多给些意见，多一些支持

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