人胚胎干细胞培养

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人胚胎干细胞培养，共享资料！

syl82

9 q: `! r+ a, C, y

# u% S, Z; a. K培养条件 ! ^. ?. l* v/ z' o8 u. D% Y, M
环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。
; y; S3 q& E2 m设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
* y" `" _- x, ]/ [" U: E实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。
' c7 d0 H. s! x试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。 . Z1 b2 {7 @* ?, N! T$ u$ L# I0 ?) M
试剂的配制：
2 z9 J0 h3 C, @2 B" ODMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3
1 N) F1 n5 F! ?$ G6 Q( C2 Q+ fMEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素
5 r0 T  D! M; rES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子 $ u0 O/ o( @. q  H
D-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红 1 H: F% \. ?6 T6 `& ]9 x' e. Z! l
0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶
4 T2 y  t/ R. P8 f* G+ {- \8 uES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO 6 J" w3 ]2 q- T8 a- m
MEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO & i7 z! C, c: _0 q- P; z+ {( Y
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO
6 A2 W5 Y% a  y) F: {9 X5 c# O丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制 4 z: G3 `8 C6 D! Q2 Z8 {
培养步骤
8 b/ ]5 g* E) ~: J6 N) P* p& u常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。 / s, _3 J  b( o3 w: H* f

0 k" F0 g  N9 O) @: K小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 : G, k- j: \6 m9 _
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 * ?' _' [# r: m: @1 x! L; N
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在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 8 L! j0 H/ ~# `/ `& C! c& ?5 v6 \
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 3 @9 T0 c" w2 X6 V: U
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
" y/ F& u& ^# e+ I  W# W; \根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 2 ~, a1 u! g8 D0 o
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 ! y. ~( D/ a8 w" F4 }# r$ Q% u
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
( P, ^, p$ {' d! @把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
1 n" ~$ f% w# Z7 A. `1 \0 y用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 0 m' W. a' \3 X) x. E
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） ) v" N# O" U1 I* O( }8 `- I3 y
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
! Q, |: y/ t* M# I5 D" E: B小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
, `2 G# X/ D) i# j3 Q' W在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 2 h8 y2 v5 A8 e' o! h7 r# C
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
7 v) g& Y$ d, {8 d# r吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
! b1 Z$ T' Q% W$ ~根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 , U* Q' V; ~3 j5 {5 v. ]
小鼠胚胎干细胞的传代 % n- u) y: N/ K2 N  Z6 e
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
, Y& ^- K- F. E$ D! V* R. X5 W用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
9 r3 q$ v& {# N  `# B去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
( o# `: r& H9 g% L# j0 O+ t小鼠胚胎干细胞的冻存 ; @9 b; ]* j0 i9 c, T1 Q
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
1 G* X, M2 Q: T" ~用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
. Y) D& y, C* J去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
$ }; H! q! v$ p2 l注意事项 # L: b5 w7 R6 ^6 |/ r( ~- P+ x
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 1 N% E" ~  m( D1 _  Q" C
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 ) g+ Q1 ]/ c; o' \: u
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
9 `9 l! f. c' r" {2 o# j为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。

hcluo

给的十分详细啊！