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也就是亚硫酸盐测序法，关键是设计好PCR的引物，一般为两轮的巢式PCR，甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。希望能够对大家有所帮助。
: m* S" B6 d0 h6 \ a4 F" C第一部分 基因组DNA的提取。
( s6 R. j Q; p: j0 m这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
% h& T& n( n/ O: w& a此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
k. u9 j7 y7 C使用两者的细节：
- x, T! J) D2 X8 K# ?1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
' R$ |8 e& @: ~+ M* e/ |: S2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。/ S5 w$ f3 j, i$ R: r/ q6 J
验证提取DNA的纯度的方法有二：
6 T& ^; t2 G& ^6 {1 O9 \1：紫外分光光度计计算OD比值；
8 K6 Q7 z1 c5 O0 J1 `$ [2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
- N! z) s( Y9 P5 S8 k, f9 B2 _我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。4 K2 O W' o" G' L6 _9 _
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第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
2 [* y2 w# u6 z3 {4 K( _7 ]. Q如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
6 }$ `. g. W) A1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
/ R0 i, y8 T$ @( h. q- [/ f4 l2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
}1 `1 B' W! W6 \2 ~( Q5 r" K" c3： 42℃水浴30min；! P) I$ X# o* o
水浴期间配制：( P- {! {0 Q- p; B8 X ]
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）6 _4 m: B/ x4 F W; G9 D$ ^2 _
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
4 E5 }( D5 }2 z- ]0 {5 c }6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
. H4 M, ?! k$ R0 m+ h) r7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。( G/ X& S) h( a( M+ d1 I! Q* |
8：50℃避光水浴16h。
5 H$ _ f9 ? }% ]2 }/ @一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。
& d9 r2 P: P- i0 @& ^, j这一步细节：
I3 ^/ d- Z. A1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
, Z8 R) V- r0 D; }2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。
% Q* z5 V2 J8 b5 P" i3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
& i# E6 i# d9 u" b9 N1 X4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。 $ A% f1 R. S X" A; n0 b) W
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第三部分 修饰后DNA纯化回收7 g9 @% u( l* M
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。9 J" Y3 b; m3 ^
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。
3 q; y8 n3 V. M/ o8 v2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
( z9 |8 y& Y3 d8 G- a( e/ {1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
7 r/ a" O5 q+ C6 e9 @2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；' y4 \; v5 S5 o; ~
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
7 n# |1 B. j9 Y4 U3 v6 F4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。
# ^* b0 U5 M2 |; w6 ]& A. G5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。
% v, e6 [% [2 z# g2 M: L2 I6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。
3 v6 ^5 q3 o: ~2 @+ N/ K7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。; \. |1 B9 ]/ J% D) _4 J" {
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。; A3 g3 b% v. h
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。
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5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。% ~" H% @. Z0 v
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）# D9 k. q: \ d+ c8 z7 e% E
7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。5 _# o+ R1 _6 n4 C' F1 ]
8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。" M% {& J+ R! ^- ]" B4 m
9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul-30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。3 X. t% I: ]& Q; J
10：-20℃保存DNA溶液。) p4 z4 s3 A M* a8 S
7 U, N2 L7 M6 s此步细节：
' Y6 C: ^6 {- D" h& E, E. ]1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。6 K- x* E6 h! s6 F. i2 x/ D
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。
, E' h7 Z% X/ P u( V! y) j3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。
- K, K+ ?- I) ]此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。
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* M, T+ T$ s* U, E1 D, a# z8 y3 ]第四部分 修饰后DNA用于PCR: v: y4 M" i: Y% M# F8 | E, d* e3 i
这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
$ U1 F# m- n$ s: q, Z2 e1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。- [8 \) j" U% W
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。
2 N# K; [ u8 l* h4 s# d& ?7 q% m- e3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。( x* T% ~7 b5 H) b+ \! e
4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。, U& w$ p# P# u' ?+ b. u: J0 Z! g/ J
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。9 h% ]4 M/ t% ]' C# w
这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分。 ; \# I$ g9 a& J! Z; U: w
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第五部分 PCR产物的凝胶回收
, M6 \# F4 o: _' [这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。
) _+ M. Q- ~; T: j9 e7 w9 d% i几个细节：
% Z- D8 V" k* P$ W j1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。
3 d5 a1 S) ~! |) v2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。, {* I- K5 u3 i% t
3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。
& ?) M. W- P4 t6 [( T( u0 }4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。$ U4 C# G. M* O. T* Y" W
: {' j6 \' g& G第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
( L. \: v$ X" x8 K, L5 W$ V7 }1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）: x$ t# ~, D5 R, |" H
15ul体系) |/ g- f) Q* r' u' m
T-easy 1ul
$ a! [' p$ N8 ?& a8 D" fLigase 1ul ; N5 y8 d6 C0 L6 S! k1 X8 p( O; I
2xbuffer 7.5ul ! _4 P) I \9 Y) A. `% l
DNA 5.5ul
/ i- ^% b) g% ~$ w4度，过夜。 5 s9 Z% ^$ M6 T" x" Y0 g0 S
2：连接产物的转化
" T- I" p! v7 W' V0 E1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；' s( y7 `& C6 o; X5 o# r" W
2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；
9 Z" U3 C+ U7 _5 W) q7 A. q. a- c3）42度， 90秒钟；
) y0 l( p/ N7 G% u5 h/ f4）冰上2分钟；" i9 S- Y3 L% {1 `9 `6 m y' |
5）800ul LB培养基；$ }# p( g$ z& ?% ?
6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；6 M8 b) `# l; o; I
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
) \7 L" R+ [% E7 x( V8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
2 H. _2 V7 Y" d# W8 P" P; a先涂：X-gar 35ul
8 @$ n5 v5 I3 pIPTG 25ul 2 l/ n2 }; i' ?/ r$ X1 W* d. q, C
后涂：混悬液
) R+ }! G; B. S! t( X: P1 b; o过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。' v3 g D! a7 ~9 a9 J, J
3：取白斑，划种于新板上2 Z% J5 @. @2 u2 _7 h
新板：先涂：X-gar 35ul
$ o$ y0 N! q% g+ [. B3 XIPTG 25ul
+ |6 ^6 p: l- }+ i5 [$ e. @然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。 ) s5 F+ M2 b* U. Z
针头挑白斑划2道于板上相应区域内。
' A, c H3 u6 l& n9 @1 O* g0 I37度，孵箱过夜。
; d( n! g- t' W1 A2 J( W4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。; Q! k4 x& M# n
+ S; q( z' U ]2 B这一部分的细节：* c- M) T7 b9 e# F* Z3 n
1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
3 @1 S' G0 `- N( t* g' `, r' U k2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。
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发表于 2010-12-25 09:06
