求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

肿瘤细胞在无血清培养基中形成微球体之后，传代的时候要用胰酶-EDTA先消化，吹打形成单细胞悬液，然后离心，之后重悬分装吗？是这样做吗？4 }/ a- m; [& Y
大家都要用胰酶-EDTA消化吗？

深海寂寞鱼

to cookiezhang：9 B! Y# e8 ~) ?$ K* D+ T7 l
: L: u' B+ W( e7 S. @
肿瘤干细胞的微球体或者说肿瘤球的传代过程大概是这样的：
1 h: A2 x0 g  S/ O# L
' A. e& i9 h5 A& [4 ~; {8 R1. 离心收集肿瘤球：300g ， 5min' L8 {, ?) c# x% i6 n, R! {+ B
2. 弃掉培养基，用PBS重悬肿瘤球/ `, N1 s; ?8 z4 A! N* V7 K
3. 离心后弃掉PBS4 k" z& Y2 }4 K4 z$ S( X
4. 胰酶－EDTA重悬，消化肿瘤球（一般 37度，5min；可根据经验调整时间）。每1-2分钟，用手指Tap离心管底部，使细胞悬浮。
' A2 ~6 r* H3 `& R8 S5. 加入培养基终止消化，适度吹打使细胞进一步分散# Y0 X# H8 a) l# U1 b
6. 离心后弃掉上清，培养基重悬，按适当密度接种。1 q9 q$ m- U6 r3 A  t  Q: I

- p7 t6 L- ]6 Q/ s! x5 s. L7 V这只是一个大概的操作过程，其中的每一步都可以根据自己的经验，尤其是自己的细胞状态，进行相应的调整。
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我现在基本上用Accutase代替胰酶－EDTA消化肿瘤球了。主观上感觉损伤好像能小一些。但是胰酶－EDTA绝对是可以用。$ ~4 F# r" V& |" f5 B+ X5 o

. ~- c) S! F8 s+ N0 G3 X$ C( M3 j6 Q你先按照这个流程试试看。如果有什么问题可以再交流。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子+ w( L3 {! ^- F1 {2 L, q
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非常感谢深海寂寞鱼。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子1 g) u. c: Y/ p& M0 @% `6 q3 }# m
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想请教深海寂寞鱼：培养细胞球用的细胞因子EGF、bFGF，你用的是什么公司的，是直接分装就可以用的，还是有干粉自己配制的，哪种比较合适啊？

深海寂寞鱼

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. w8 M. \1 |7 ]/ z7 y. S8 M" `- v* [) q* p$ I! Z. ]- y9 \/ J. }. v- K
to cookiezhang：
- M; x; C2 y# {: F7 b7 M% o# O/ d6 X2 u+ N0 M! V0 @* y
    我用的EGF和bFGF都是Peprotech公司的。都是干粉。自己配制后使用。

jamquit

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$ K/ Z: M3 w/ ]3 n& i8 E( u7 y. m请教下深海同学 有师兄建议我的无血清培养中除了EGF bFGF 还添加白血病抑制因子 不过我看白血病抑制因子是促进细胞分化的呀 而且像胰岛素这些需要吗？还是只是EGF bFGF B27加两抗就行了？

深海寂寞鱼

to jamquit：请问你打算培养什么细胞？然后我才可能稍微准确的回答你的问题。
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, g! O& U; u. I3 C4 O5 Q4 w' O, x另外，有个小建议：希望你能自己多看文献。因为任何人给你的建议都是从自己的主观出发的，适不适你，你自己必须学会判断。8 ]/ j( W4 `4 r& B7 y2 S4 O7 B  Z

  V6 F. J: @. F( r" `& d# U而判断的标准一般需要从你读文献中获得。
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. l+ z7 {* W' S比如，你师兄建议你不加EGF和bFGF，你就可以问问他不加的原因是什么？有什么好处，有什么缺点。加入LIF又有什么优点，可能带来什么不足？
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再进一步，你应该通过查找资料明白EGF、bFGF，LIF它们各自可能的作用是什么。, K7 ^8 x, E* P( J  c: d
; ~4 P& q7 B+ G0 ^
只有这样，你后面的实验才可能很好的开展。1 G/ o' _6 ~% b: ^
" \5 \8 b, q- H4 k
个人的深刻感受，与你分享。希望你能明白。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子5 {- H- L1 Y$ j

  U3 a+ h' z1 k恩恩 谢谢~~~~等我再多看点儿文献了再找你探讨吧~~

lh_kitty

回复 深海寂寞鱼 的帖子
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+ P$ E& l7 V3 n6 k8 P1 z你好，请问你培养的是什么肿瘤干细胞？我现在在养食管癌细胞，用无血清培养基养出来的细胞总是有贴壁的，传了几代之后还是有悬浮有贴壁的，不知怎么解释，想请教一下你在养细胞的时候是否遇到这种情况？

深海寂寞鱼

to lh_kitty：这种问题当然经常遇到啦。
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                我养过几种肿瘤的原代组织，但是确实没有养过食管癌组织。0 N6 u/ B/ m3 y, K0 s1 e
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                就我的经历来看，胶质瘤的原代组织会乖乖的长成悬浮的肿瘤球，贴壁的较少。
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                其它的肿瘤都有不同程度的贴壁，有些会比较严重。
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                论坛里对于这个问题，大家也都有提到。解决的方法或者说改善的方法，大概有：
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7 l7 a' S7 u5 P# y% y2 h                1. 如果实验室条件允许，尽量用超低粘附的皿来进行培养。4 g; {. A9 W9 K4 D; E& q# c7 s

" w3 g! C# e$ S3 z  H3 Z                2. 控制细胞的接种密度，稍微稀一点。
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                3. 多加一些培养基。) L& B: l& _# M* i! W: n% h, Z
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               你可以按照上面的方法试试看，个人觉得你是不是细胞接种的比较密。( k9 l: V$ C9 F% D# e6 Q* N* l
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               当然我一向的观点都是尽量多看这领域的经典文献，从中找到解决问题的方法。" o6 s3 b2 m: c$ r) Q) \

+ g' Y4 i' w( e6 e: o- Z  \% k               如果你认为悬浮状态的是你需要的细胞，传代时尽量轻轻的吸取培养基进行传代，贴壁的暂时可以考虑舍弃。% J, t9 ~! n2 M# t0 T& u: J
& n# \; t- s0 ?5 O5 p0 Z0 Y
       你问我对于这个问题的解释。说实话，我还没有太想明白。  1 r5 ^1 W: G1 `
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       但是通常会认为贴壁的细胞可能是分化了的或者开始分化的细胞。我还在观望中。