欢迎培养MEF细胞的同仁们进来分享一下培养经验

mbjane

我最近开始培养MEF细胞，缺乏经验，按照一些PROTCOL操作，但是结果不太理想，也不知是什么原因，还请高人指点。
! o1 ~" _: C0 R/ o) k3 M过程：取孕期13.5天小鼠的胚胎剪碎消化（含EDTA的0.25%胰酶，37度消化15-20min），培养基成分为DMEM+10%FBS，接种24h后半换液，然后为3d全换液，细胞至90%融合时传代。有如下问题请教：
7 L( C9 T, l1 O! Z- g: F6 L1、培养基的PH值采用多少啊，我看文献中好像没提。我们采用的是Gibeco公司的DMEM干粉，每升加3.7gNaHCO3， 过滤后使用；6 K6 r2 W: ~# G, o
2、原代培养接种时，细胞密度多少合适啊？
, ?. C+ @% U) B本来按一个胚接1皿（10cm），但是后来发现不同批次老鼠的胚胎细胞数量相差很大，如果接种密度较低（1-2x106/皿）时，细胞状态差，若较高（4x106/皿）时，细胞状态较好；由于不是来源于一只老鼠妈妈，所以不知是否是因为细胞来源的差异造成的。& j' S1 V5 x4 `' j
3、原代培养时，细胞形态呈现典型的成纤维状，但是经过传代后很快就变得扁平肥大，甚至会出现传代长满后细胞数与传代前比较没有明显增殖的情况。  E) F! w. i9 Y# }7 R+ h' ^
4、培养MEF是否一定要在皿底铺明胶？  s& [: ]& h; @& S
5、如何评定培养的MEF细胞状态呢？

huozhicb

1、没用过，直接用的液体培养基0 j1 e  I, U3 m1 R) M. I% t
2、不知道你消化的程度如何，是将整个胚胎全部消化吗？这样的话没必要，因为MEF细胞主要在真皮层的致密结缔组织里，是间叶细胞的前体细胞。
$ F6 v4 A+ Q$ N4 P另外我感觉你接种的密度偏小，我一般是每个10cm皿用3-4只小鼠（不全部消化，未消化的弃去）。因为MEF是在低密度情况下生长缓慢，而后期越长越快，所以一开始就可以密度大一些。
+ N2 S+ S  s: @, ~3、不用铺明胶，做Feeder时用上就可以了，甚至做MMC处理之后都可以不用（不过一般不要这么做，除非你的培养皿够好，换液操作规范）

lorey

1、DMEM从来没用过粉末的，所以不清楚。
% D5 }8 m6 j* y$ ^2、原代接种时，我们是按照一个胚胎一个10cm的密度接种，没有计数（我们是完全消化的），但是感觉细胞密度比平时要大。细胞来源不是一个鼠妈妈，也没问题，我们都是一次性杀几只，把胚胎放在一起处理的。
$ p6 z& J% E6 U! m% |3、单纯培养MEF，不用铺明胶。我们培养小鼠iPS时，也不铺明胶，只有在培养大动物iPS时，feeder下面才铺明胶。
! g/ L$ ?! ]2 s5 i4 x8 l+ U& ?) F' v4、判定MEF，我们只看两点：生长速度（一般两天传代）；细胞形态（原代细胞经常有些神经细胞，但随着传代，就会减少甚至消失）。

bubble_w

1、细胞培养不像胚胎需要一个严格控制的PH值。一般公司买回来的DMEM我们实验室不添加任何NAHCO3就感觉不错。有时为了提高细胞状态会添加一些GLU。7 v8 P1 |+ O% |. e1 }, s0 U
2、原代培养一般是2-3个胚胎接种在一个100mm的皿内。$ \3 f7 k# S3 c& A
3、一般MEF的培养不需要明胶包被的皿，在处理为饲养层后接种干细胞时才需要。
6 j! f6 c5 a6 o7 k9 E  v) }; C4、对于MEF状态的评价主要是以增殖速度以及细胞的形态是否为紧凑的不规则多边形为主，同时还会注意细胞是否有支原体污染，这个是原代常出现的问题。
: u# x4 n* ]) R1 F& q/ c# }0 B) B0 Z' x# I. A+ A1 Q% Z4 c$ R
本人做干细胞以来，做了无数次原代，以下是一些摸索的经验：
- H' r0 V( Z: O+ B5 Q5 ]( \. N1、MEF的状态其实主要取决于孕鼠的状态，一定要清洁级饲养，否则取的胚胎质量差，做成的MEF差别会很大。2 z: E1 a6 x8 `% [5 i# N, w: w' Q+ w
2、制作原代过程中，一定要尽量去除除MEF外的其他细胞，纯度越高越好。
. G3 x* H! r6 x2 `% N3、建议原代中少些带有组织块培养，MEF活力高。& M+ D' n  B# Z" t, L! [! F% m! K
4、一定要注意外源污染，一旦发现立即扔掉培养皿。4 T) r/ a6 V* W8 R. A
5、细胞一旦出现形态肥大，凋亡的形态，建议不要再继续培养，再做新的原代。0 U* `( i% L- g+ [
6、我们的经验是一旦做了一次优质的原代以后，可以传至第五代再处理为饲养层，细胞状态仍旧非常好。这样可以三个月都不用再做原代，关键是一定要从胚胎时就状态好。

mbjane

回复 huozhicb 的帖子( s+ _$ I' D8 U* ~1 y3 O& x* S$ z1 \& W
7 B% @8 Q# |# M! ^& L. Z! J) C1 q
谢谢您的回复，我们消化主要是看消化液的颜色变化。至于是否消化完全我也不太清楚。请问每皿结3-4个胚胎，有记过细胞数吗？原代培养几天传代呢？

mbjane

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谢谢您的回复。您提到：“细胞来源不是一个鼠妈，也没问题，我们都是一次性杀几只，把胚胎放在一起处理的。”我下次也会试试这么操作。请问您原代以后的传代接种密度多少啊？

mbjane

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1 P8 Q$ T$ X& ]- I7 i8 v/ y$ p5 g' H/ F
非常感谢您的分享！想再请教您几个问题：
, q# Y, t2 Y* w; _/ r0 N2 |1 k1、请问原代培养一般几天传代？
0 S: k, u& D, ]2、孕鼠的状态可以提前预知吗，可以控制的条件有哪些呢？对小鼠的品系有特殊要求吗？4 y4 h- t& J1 E/ A( V' Q/ m7 Q
3、尽量去除MEF以外的细胞是指取出头、尾、四肢和内脏吗，还有什么注意的吗？" g( K7 Y, h% S$ O- u& _6 C  S1 L
4、/们一般将组织消化后果100目的筛网，用研磨棒促进细胞过网。请问您是如何减少组织块的的呢？
( W9 L( n4 Q6 l* `. w5、原代后传代的细胞密度控制为多少呢？我感觉2-3X106个/皿较合适。

huozhicb

回复 mbjane 的帖子- Z9 U$ z- N# v: H
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原代没有记过数，传代时间不定，只要长满就行，原代长满后一般1:3传代。

happygrass333

你好，首先过程上来看，我们不会直接把胚胎剪碎消化。是把胚胎分离出来的小鼠去头去内脏，剪碎消化，消化时间也比较短大概有5分钟，培养基成分也是10%的血清的培液。
& c) d$ Z6 |/ F! l- A: c/ U5 c培养基我们是商品化的DMEM液体的，ph大概曾经测过大概是8.0，记不太清了( D  w) R" h0 k5 }
原代接种我们都没有计数过，通常是看离心下来的细胞量来估计，做得多了比较有经验，控制在2-3天长满，然后传代。  J4 p/ P9 d7 F+ ?3 [& R/ X
不同老鼠批次做出来的结果是会有差异，有的细胞小，有的细胞大，所以计数不是很准确来确保你的密度合适，多做几次就有经验，控制在2-3天可以传代的密度接种，我们一般8个小鼠可以铺到6个10cm dish。
! |) C+ M% `% C+ F& w$ N6 X" b你说原代培养成纤维状，其实mef刚铺下去是铺得很展的，过24h就看到变成纤维状，传代长满后貌似没有增殖，其实你会发现细胞变得小小的，说明细胞数量还是增加了，长得不是单层了。gelatin不一定铺的，用的dish好的话，很容易贴壁的MEF，状态好的MEF更容易贴壁。
* U( V: F/ m& U& d8 u8 @评定培养的MEF细胞看形态，是否铺的展，不要饿成丝了。

mbjane

回复 huozhicb 的帖子+ @7 M; a3 G9 v5 n  l( d9 X
! D3 t3 d( Q" O4 {, e- ^. V
我前天原代培养，2个胚/皿，计数为4.6X106个/皿，结果昨天（24h）发现细胞已经90%融合了，我也按1:3传代。