pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

runsong

6 ]3 y( L' A5 e% H4 z
- F" Z2 j1 ~; r. V% ?4 ~
本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。  ~. E, }' \2 m& W% D' L
但有几个问题想求教各位前辈
6 h0 f0 z: W" i4 W1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。
* w, b1 E8 A5 {& |2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。
+ {) ?! o$ h1 r* I. ~; V5 r. a: N

runsong

本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。
% r* t) s# h+ C! E但有几个问题想求教各位前辈& W: M3 b% E/ B9 f# a3 O
1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。  v4 \. t  h, h2 R3 f
2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。+ ]: K4 q+ G% z- g1 Z- |

深海寂寞鱼

to runsong战友：
- m2 ~) K1 q0 \0 Y/ n
3 h' T* F& ?( w+ T% x- w   你的这个设想是完全可以实现的。我们实验室就是这么做的。
8 p7 n2 {0 @1 G
, S/ |, H: W8 R) S   有两点需要注意：# N7 h# Q: O8 @9 E% `
+ B$ S4 l' o: @
   1. 因为pEGFP-C1载体最初是设计用来做C端融合表达的，EGFP的末端没有没有终止密码子，它的终止密码子在多克隆位点的3`端。
2 e( c9 X. f" m: @/ z; V    # W7 G  _9 ]* D
       因此如果你想把你的pri-miRNA插入到多克隆位点之中，就要注意在pri-miRNA的5`端加上终止密码子。
- n% J' N$ f8 t# e+ I8 ~& p( y0 ~3 T& v+ ^
       我是用BsrG I和另一个限制性内切酶将pEGFP-C1切开，然后插入pri-miRNA。5 v0 m. c) @0 O" r0 V4 _  v

5 T5 X- ?+ F7 G7 Y5 f% C; s3 z       由于BsrG I切开时，会切掉EGFP的几个碱基，所以会在pri-miRNA的5`端补上这几个碱基，并且加上终止密码子。
* H9 p" ?) z( @: n1 S0 R/ i! V) P4 Y- [2 a) y
       这样做的最大的好处就是不会使EGFP多任何一个碱基。0 W1 N# N* M% A# [# u8 W% C5 k7 A
/ h6 Q; Y5 W& n+ M: j. D7 R
    2. 在克隆pri-miRNA时注意克隆的长度，以防pri-miRNA不能被加工成熟。, n& ~& s5 _8 M# S+ M
1 C" k/ c% M2 Z& V2 Q
大胆的做吧。这个不会太难的。 如果有问题可以继续交流。

runsong

跪谢大神指点

siyue13

寂寞鱼解释得好详细，膜拜一下

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子8 [+ K& i  o' n; e' y" @
, b/ ]$ S8 `0 a2 e0 E& q
非常感谢您的指导，但我还有三个问题想再向您请教、确认：
. r* y" Z1 g, \! o$ p1、若不在pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA也是会正常表达的，但GFP后会融合一个由pri-miRNA编码的小蛋白，有可能产生不可预知的结果，干扰试验。) n- W1 |4 v( T2 p# P6 Y
2、GFP是由未被卷入pre-RNA加工过程的mRNA翻译而来的。其数量要少于pEGFP-C1空载体的GFP表达量。
  k# m+ k4 q6 q# v2 _3、pri-miRNA克隆的长度有何硬性规定，前后各延伸100可以吗？
$ O/ w, P  D$ }& p4 Z4、能否给我几篇您已发表的文章供在下学习借鉴。
* ]  P/ u5 _% y! G& d最后祝您好人好运好心情！

深海寂寞鱼

  M& O8 z. h; q1 M* z& ?
% U3 H& }( R( e1 d3 x* B回复 runsong 的帖子
. p5 @. h1 ]) h: e; S, s, I! k7 _" b8 c# S
to runsong兄：2 E% h8 H$ b+ ]$ p3 s
; U# z2 i. S1 C
    指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。2 u: ~* V6 Z2 u

5 i) L- T8 M2 l$ a  A$ u* d    对你的问题回答如下：8 x% C1 a. W3 v/ v6 y
, M' `# w5 j6 Q; e- k9 z9 Q
    1.  若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。
9 g; d3 V( c; u, O1 p
  w/ F% u. P2 Q- |  Z3 |1 Z' w         当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。( `5 U* `3 w( `. N

; S3 R0 z" V& k& f; r3 p       而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。
5 B/ j( c" b9 d1 |9 u/ z5 {7 N. x' W* V2 h% ?, K  E) A+ I
        所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。2 M& F; |6 g- }2 |- O* B7 F2 v

1 t1 I1 m; v' G# |* V; A      2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。
5 O6 i: A6 z5 h( b; O3 i1 e, x
4 l$ h# ^& F4 Q' c          因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。
2 L4 h6 R8 b& p; A( L4 E: X    " J- c, v- ]& o7 K' F3 g
          GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.
/ m, n( K$ v6 ?5 ~7 L: K   
5 M5 p( c" e! d# f1 g+ Y4 Q       3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。" o3 N  l! s+ @4 D/ _
        
* S/ {/ I. q% t1 j            不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。$ H- }0 a/ v1 z
- G( V2 a! ?' Y% ]! J5 G
            或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？  
7 o# t0 D9 }( Q; b$ Y" Z/ T: O- t5 O7 r! {0 E
; ~, b5 i$ y1 C  `' E6 A
         4. 我目前没有这方面已经发表的文章。& ^" i* f  z: H% M3 P
  4 C2 V% E2 `3 A" [
             但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。
9 P1 p6 b: J0 Q" n* C2 @
$ g( L. L$ [. P5 n# D: S1 \1 s4 _* v. ~. L7 S0 k4 \% ~
            最后，也祝你实验顺利，天天开心。
0 J" W2 F+ `) E8 @% h- U

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子
- e- y8 b9 [3 V" e- e0 h2 w- }2 L( w; \. z
我画的这幅图有错误吗! D, y6 }; N. }% u5 _

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子7 v7 U8 w% s# B; t
) m' k% H6 n( d- Q* l; A" A- b
呵呵 ， runsong兄，你绝对是个天才。& t7 y! o2 X4 n* G- j6 Y7 c6 `* {
8 D4 D0 u- `3 @6 p' n9 A
我也很喜欢画图来说明问题4 ?" ]2 `& X5 q, Q
; U9 C% q- h+ A# n% t
不过跟你一比，我差的就太远了。
9 A( E% A2 T) S$ t, J
& w- O9 n+ T) O0 b9 E  t. \你的图怎么画，教教我啊。
0 v9 a' W9 z" n- r  E- ]3 T. E5 L. Q4 k& y
貌似你要做miRNA-34 ?   呵呵。。。。。好像文章不少啊。还有个miRNA-21在肿瘤方向的文章也不少。

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子
5 K# g- p0 v  }, g, j, n4 M1 j) O! X* b- u0 [6 {/ b, i
载体图是用clone maneger画的  其他一切操作用的都是PPT或PS  8 g# m2 W. C" r' n% `) f
我是土八路，信手涂鸦