pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

runsong

, x& b+ q% P& c6 n
' n  j- F# }9 x* o+ u本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。
2 `2 D# q6 Q' O( R& y6 k但有几个问题想求教各位前辈( I1 X6 _) N* N0 T
1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。
4 n6 R, ]; y# b/ R% o0 E4 K+ ^6 z2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。
1 [7 U5 P. b4 C, o' ~( A& [

runsong

本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。6 s) @+ ~; y9 V1 F* J5 A
但有几个问题想求教各位前辈& ~4 h) r4 `! x9 O0 p' g% ?
1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。
/ n# m+ C8 w9 z3 u6 p; O  `2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。6 I6 z$ R' [- G( S

深海寂寞鱼

to runsong战友：; F/ E. s5 B; V( b* h0 N
. p6 u# ~1 s1 `$ K) n
   你的这个设想是完全可以实现的。我们实验室就是这么做的。
$ @1 z( r- w& j; K7 d6 \6 s( G% W
$ Z/ B# |9 C# c. e   有两点需要注意：" v  b* f, r- ?: M

# k6 f% O6 c7 U* C0 b   1. 因为pEGFP-C1载体最初是设计用来做C端融合表达的，EGFP的末端没有没有终止密码子，它的终止密码子在多克隆位点的3`端。
; w% S5 v3 p4 v" f, r) p. \) I   
0 Q$ i: p: M. b; }) @$ e       因此如果你想把你的pri-miRNA插入到多克隆位点之中，就要注意在pri-miRNA的5`端加上终止密码子。, I) l4 p4 w( C1 y) z! `3 _
: t$ e7 p6 g0 N" ?1 `
       我是用BsrG I和另一个限制性内切酶将pEGFP-C1切开，然后插入pri-miRNA。: k2 ^  J1 l3 C) Y% c( U* ?) X
  V" g7 c* t" Z( K6 ]! d7 K5 v
       由于BsrG I切开时，会切掉EGFP的几个碱基，所以会在pri-miRNA的5`端补上这几个碱基，并且加上终止密码子。& m: m7 x: I: s9 j0 A* U' w$ [+ w& x
* T. E; j5 m3 ]/ _5 C4 }( g
       这样做的最大的好处就是不会使EGFP多任何一个碱基。7 s' b( c, y$ P: d2 S

1 q' C# R$ D+ u; r3 m7 r    2. 在克隆pri-miRNA时注意克隆的长度，以防pri-miRNA不能被加工成熟。& f3 K9 Y1 T* d: X  `
5 i3 T7 f$ e' D7 ~# s
大胆的做吧。这个不会太难的。 如果有问题可以继续交流。

runsong

跪谢大神指点

siyue13

寂寞鱼解释得好详细，膜拜一下

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子+ {' I, z$ X) a" c8 O7 O

, e! a/ p4 a; G# V6 |5 [( J4 u非常感谢您的指导，但我还有三个问题想再向您请教、确认：/ [9 N: A' Y4 s9 l
1、若不在pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA也是会正常表达的，但GFP后会融合一个由pri-miRNA编码的小蛋白，有可能产生不可预知的结果，干扰试验。
' y" B7 `3 ~( m; X2、GFP是由未被卷入pre-RNA加工过程的mRNA翻译而来的。其数量要少于pEGFP-C1空载体的GFP表达量。
; G) P& b0 z- p9 b& u; r! y3、pri-miRNA克隆的长度有何硬性规定，前后各延伸100可以吗？, m/ N! p& M7 n
4、能否给我几篇您已发表的文章供在下学习借鉴。% U( r$ A: f. i# W! V% G
最后祝您好人好运好心情！

深海寂寞鱼

) K5 V; z5 d, L0 Z, B3 o$ ~' q
+ {# L4 Q7 H# D' J, _; L% j, [" b& B1 F回复 runsong 的帖子
5 Q0 E5 N, d7 G5 R8 x$ \# R4 q! f3 S
to runsong兄：0 u  v' O  g5 h! Y( Q) l6 R! R
1 E( h1 l1 |" M
    指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。' r( @# u7 z9 }: y! X' T) B

& ^2 x3 N$ r! z2 l' g* h    对你的问题回答如下：; J: a! H; D& }0 |9 R
1 h- {% K$ e! i. g# M% k, _
    1.  若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。. v5 M! ], U  m! s

$ P8 `' W4 Q" {& a         当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。9 I8 i4 H! O; m/ U5 U

5 o# s7 Q7 s6 H) p4 {' t  a8 b       而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。) s% f3 P# b: p; R% f& A: O
% \% {/ |8 s  d5 `) G3 N
        所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。
  z2 ~" X& m. {4 S  |) E( _+ w- J8 \. [, T: ~& ]7 k
      2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。) f3 f- n7 X% R4 T8 l1 @# K

) J( v, H4 R: M9 y          因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。+ Z) K) I2 \7 g' A' [
   
6 }# d, \$ x) L: t1 I! ^. M8 w3 a          GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.
: J( j4 o4 ^& a* v! p1 u5 N    * T! }1 s- X9 U! m0 O! I
       3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。' s/ ?, l( Q0 {. R5 X; f# y
        # Q: [8 u% x7 m
            不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。$ P7 o3 z) l; m

& q" c$ R4 _& ]1 D, T* e& V            或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？  
" n9 Z2 `7 L8 t& T% s0 |1 v% I
7 h2 Q' ^) X( {4 N
# w4 e% z* Y) t8 ~         4. 我目前没有这方面已经发表的文章。
& \) Y: R6 Z% W# Z4 o& }$ l  
& x9 h& L$ F8 e/ [             但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。
+ H' M' i6 g# T6 w/ j; A. \  H4 b  P0 ^# a' f

7 w- Z( v* v6 g            最后，也祝你实验顺利，天天开心。
2 C) ]  N0 j9 M

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子+ f$ L7 b; W* x3 O/ l3 L1 I
9 U8 x9 H; Z+ b& @! }2 R  B
我画的这幅图有错误吗
: t. B9 V- r9 ?7 M

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子
* D! p  A1 N- S- w5 W5 r# F! R, e2 y7 X8 M- X
呵呵 ， runsong兄，你绝对是个天才。
3 t; G7 A2 W) F" X2 o) E9 Y( O# ~, n8 M9 _
我也很喜欢画图来说明问题8 Y) u7 H, ]; z& k7 I
" v" Q; _- I9 p, X
不过跟你一比，我差的就太远了。
! E" Y% A: i( K5 b) {7 J5 J  w( e2 Y/ F$ d6 X
你的图怎么画，教教我啊。0 H/ j+ X' u; P6 }& ]
% a- f0 x+ e% N
貌似你要做miRNA-34 ?   呵呵。。。。。好像文章不少啊。还有个miRNA-21在肿瘤方向的文章也不少。

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子+ I3 a$ W1 q" a9 h6 n' }
5 ?# }+ G; ?3 @' ?" Y
载体图是用clone maneger画的  其他一切操作用的都是PPT或PS  
" ^2 r, q9 E2 l  u. p我是土八路，信手涂鸦