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本帖最后由 深海寂寞鱼 于 2011-1-13 18:04 编辑
1 n: s- k" g% r# l/ k
9 h6 B% o: @0 L8 Z, c8 C% c回复 runsong 的帖子
6 A. c7 I7 e: z2 g
Q- Z- n% D) ~, p6 a* [" P2 n. M4 |to runsong兄：
8 n! @; Z' r4 P: D4 f/ |6 @$ [2 ?3 f. t/ y$ i' l
指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。
0 B8 j9 m; {, C( d o
1 K9 [& @0 r8 [2 v# o/ j3 S/ p7 g: z9 } 对你的问题回答如下：
& v' x# w5 ]7 o3 X
1 E! S. C: t6 F* [ 1. 若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。/ E: Y, ]6 Y, o! b; w0 q2 A
$ e% O" z t6 D. w( o+ ~+ H 当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。/ ?: |4 W5 f+ i' m% i
" S8 R* V2 a$ {2 d: J$ m 而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。
+ A/ S! ]2 l9 O; }: e7 l3 A" t/ ^5 ~$ A: _
所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。* Q( J! t) F9 y
" `, `( j/ G' ?) n' E; g- Y7 p
2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。( h0 I7 v8 I4 @4 Y
- B8 l4 d; \' k' n( F 因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。! j( n$ l, L& ^+ w3 [. K! @# ~# c
3 t9 N$ |' [) g: ~8 o4 h
GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.% c! E5 x% g. o
$ y& T4 j/ [7 x; d3 E0 N
3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。
& R. g X, Y2 x3 \; d: | ; ^& B0 k. H0 A; B
不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。 G3 b& L4 ~- M
# k$ Q/ H& T" X, w7 f
或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？
( ?, ]& F, P" G4 P8 `0 B! E6 a; _+ k- X) m' f& C2 j
+ s/ D/ D2 Y: ~% u1 H9 V, P8 s9 ~ 4. 我目前没有这方面已经发表的文章。5 ^0 |9 j( p8 J7 F1 e
2 F7 L/ U7 d3 M9 }7 [ h. J
但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。% Z' P! x8 q7 a
/ `+ M* _. U& ~# M2 e- @* T% O* m9 s4 b4 A7 h% V- Y# [
最后，也祝你实验顺利，天天开心。 / N4 e) B* o/ O: Q5 A
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发表于 2011-1-2 17:25
