pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

runsong

1 z$ q$ u! Z# `) W

4 n" \1 t& |4 R; h4 d+ F本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。9 R5 O0 x' }0 d' c) v7 D( @
但有几个问题想求教各位前辈' b& r$ C% x' o4 p
1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。2 h! D7 z; ~; ?# z6 }3 R" j
2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。( X3 s2 Z2 L; J2 s% x( S

runsong

本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。9 y) {2 y3 _9 @" n& E
但有几个问题想求教各位前辈
2 |6 d* w7 [) {; i0 m; G3 s7 H, D2 s1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。0 s; o9 |" F8 x7 g9 T& a/ d
2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。( W; w/ T1 L: m2 T: z4 u5 g

深海寂寞鱼

to runsong战友：
) D0 y9 o& }; E7 o. H/ n" v# m' F! \! Y$ c
   你的这个设想是完全可以实现的。我们实验室就是这么做的。
3 c* ]0 Z: H# R& f1 u% [. G  S1 h% E4 {* n7 d! ?- U  J
   有两点需要注意：
/ h* H: F. q& P5 Z- V2 j- l6 o% {+ b9 b, r% n6 C. o
   1. 因为pEGFP-C1载体最初是设计用来做C端融合表达的，EGFP的末端没有没有终止密码子，它的终止密码子在多克隆位点的3`端。) l3 B: D' N! L- M
   
7 Y- M" s7 ^  [8 t1 g: M9 _       因此如果你想把你的pri-miRNA插入到多克隆位点之中，就要注意在pri-miRNA的5`端加上终止密码子。
5 m% J- A; C: ^1 ?9 Q2 ?/ y4 i  X* P' N3 z9 ~
       我是用BsrG I和另一个限制性内切酶将pEGFP-C1切开，然后插入pri-miRNA。, G- ~; L. n$ Y; ^4 J( O

4 l: G# W  U) y8 b5 X* }2 z+ b       由于BsrG I切开时，会切掉EGFP的几个碱基，所以会在pri-miRNA的5`端补上这几个碱基，并且加上终止密码子。
( M0 o4 I0 x; K7 |6 v* o# y4 W" t6 w  |6 b
       这样做的最大的好处就是不会使EGFP多任何一个碱基。* }  n3 {: x/ ]

8 w7 \7 }4 a3 s- {9 O    2. 在克隆pri-miRNA时注意克隆的长度，以防pri-miRNA不能被加工成熟。7 R* _! F+ G- t4 A
' b+ D+ V% h$ J8 Y. ~1 A4 I7 B
大胆的做吧。这个不会太难的。 如果有问题可以继续交流。

runsong

跪谢大神指点

siyue13

寂寞鱼解释得好详细，膜拜一下

runsong

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$ A* W0 X6 [3 |+ v+ B0 H& }! \5 H! X  e$ Z' \% M
非常感谢您的指导，但我还有三个问题想再向您请教、确认：; Z2 W0 p0 R1 }$ A
1、若不在pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA也是会正常表达的，但GFP后会融合一个由pri-miRNA编码的小蛋白，有可能产生不可预知的结果，干扰试验。0 A0 O% q3 Y# o! P
2、GFP是由未被卷入pre-RNA加工过程的mRNA翻译而来的。其数量要少于pEGFP-C1空载体的GFP表达量。2 V- W5 n7 N  w
3、pri-miRNA克隆的长度有何硬性规定，前后各延伸100可以吗？. K! w  O, ^/ P" o3 P! ]. W- `
4、能否给我几篇您已发表的文章供在下学习借鉴。
7 o! a, P5 m3 |0 {3 K. P# e5 ]最后祝您好人好运好心情！

深海寂寞鱼

' \8 u5 D& K5 Y/ {; E
4 |4 d5 i5 T8 [& N8 y
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% D6 a& n- b& i' W
9 G; V' r5 v8 G1 Q/ C1 ]to runsong兄：
% X% I0 a1 `2 r& L
% A; F; W& n: Z1 o    指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。
% A  H. R, U8 z+ E
, @' l$ e* e- @2 A( M    对你的问题回答如下：$ c# g. z; R$ q% ]1 b9 S

$ @$ C! d+ ^; r" S8 S- y; i    1.  若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。7 X, N& q( P) s  t: @7 [

3 b7 V9 \  w) B( r% C3 d: {, T* x( ^         当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。
8 Q! J+ k1 W* o* m% N! R% W' |' b2 s! V1 E8 }# T) c# Z
       而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。
. t! F) f( }# P  L
4 J8 f1 a  k# F2 Q        所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。
: X( s8 T# ~: C# `) {; i# n  B" b0 E+ P& S" m. Q
      2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。, X; b: L. j6 f' m7 R0 w) p
; h  D" l" s0 _' w! H% K1 [/ L
          因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。0 D+ J7 x/ m$ w5 a* Y/ |* N
   
8 `; k3 |- m2 `: p8 w& L          GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.
# ~. c, Q5 Z& H- q2 Z   
8 [! W- ~' y9 j% s       3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。. y! R& c8 |% L, y2 A- ~" l$ X/ J
        0 q* G0 Y# x4 X
            不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。- c+ g0 G6 E) v* e+ L

4 n/ A$ D4 U" T            或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？  9 V, Y: l/ Z* Q# J5 i7 k# c" W. {

# n  O' \4 A& n: T$ m
9 J( t1 t/ ^0 K- g  |1 Z         4. 我目前没有这方面已经发表的文章。  T9 f: ]0 q4 x+ ?- y$ r/ k0 c
  + {0 J8 Q6 I7 _! }& z  f& i
             但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。
  g: x# Q4 \) T3 F8 n$ x3 x0 p5 ~; R, _% R5 q+ C" [
) i; S3 P" n+ X  D$ g- P( Y
            最后，也祝你实验顺利，天天开心。
2 U2 b+ z, o) V& W0 l1 W& P9 N2 C; f5 W

runsong

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# R$ b1 L1 h7 P8 e7 C* Z7 C
& j4 s+ H- ~, c我画的这幅图有错误吗3 v9 c% F4 S. g+ C* m; ~7 P

深海寂寞鱼

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( X3 N; B# B% g  w6 h9 D0 @, G, i: c
呵呵 ， runsong兄，你绝对是个天才。0 J/ U4 j) a, s4 B

3 J& O6 x, a9 l4 T6 @+ C我也很喜欢画图来说明问题
3 G9 k/ [( B: P1 h% a0 z1 b
9 q" A6 X/ T; R: m. m4 T' p9 `不过跟你一比，我差的就太远了。( A) h' N  d# p6 h: B

* W, H% z9 k) L4 v$ `  [你的图怎么画，教教我啊。
* G+ m( E. ?  e2 x7 A8 z7 A, k. r2 T8 H% @- b
貌似你要做miRNA-34 ?   呵呵。。。。。好像文章不少啊。还有个miRNA-21在肿瘤方向的文章也不少。

runsong

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" \; J. C5 n3 V
( M. W  ?4 o" M" l$ s- u0 {载体图是用clone maneger画的  其他一切操作用的都是PPT或PS  
+ X4 u( O1 B; r我是土八路，信手涂鸦