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最近看了一些有关慢病毒转染的文献，虽然知道其步骤，但对其具体原理及过程理解的还不是太透彻，看了文献之后有了一些心得，但同时也有一些疑问，希望大家能指点一次：3 Z/ A. M- t) S; A6 F3 {4 u$ }% v
慢病毒包装简要程序（本论坛上有）% c& N1 H9 W0 m3 t) j6 E
第一天：. ]1 Y5 M! e( {1 ]( B7 W
1.用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度6 ]# |5 X0 H ~+ E7 w# l7 C' T3 g
第二天： 5 ]" \, u* J- K2 C2 B8 H
转染293FT细胞。
: i# a% J5 s- M3 U& N' A3 { D. x 1. 500ul Opti-MEM稀释2ug pWPXLd-目的基因+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G
- y ^" [- c+ A8 a3 k 2. 500ul Opti-MEM稀释15ul lipofectamine2000
, H5 k. T2 ] B 3. 5min后，将，溶液混合，室温静止30min . J' p. }$ H% s- J0 n* j
4. 从6孔板中吸出1ml培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。! y/ u8 l( g* X- i- B5 y
2. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+ 4 y; m: X/ ]7 @0 r
10%FBS（从此刻开始算时间）。
8 ~4 d' M6 X% S$ l9 r$ B第三天：
% @; K9 d! n) w& ]$ J8 L3.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上
& }" }- Y) m D: e. b第四天：, [. X$ R" P( c( ~# D
4. 48h收获含病毒的上清，0.45um滤膜过滤， 同时再往6孔板中加入2ml完全培养基
( _% ^% ]' y8 D! k, h, ?( H8 n4. 感染细胞：用一份病毒液+2份完全培养基感染目的细胞。
+ o' T+ S1 @- ]# y8 p% V4 V第五天：
6 ^( e- A; J- N" H |5. 72h后再次收获病毒上清:将昨天感染的细胞离心去除上清，然后再次感染目的细胞。9 P' T( C0 l" P% l K, p
6. 一般感染48h后，就能见到明显的荧光。
0 |" a3 \! [8 I0 W 以下为个人理解部分：“ pWPXLd-目的基因”为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过 lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的“ pWPXLd-目的基因”RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒，在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出 “ pWPXLd-目的基因”，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为“pWPXLd-目的基因”只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。# b3 q' K$ I' L- A9 g( D
不知道这样理解对不对，请大家点评一下。。。。。
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发表于 2011-1-8 22:36
发表于 2011-1-9 09:22
