SP分选的细节问题

avril77777

请教做过SP分选的同仁，添加PI后需要染色多长时间再上机检测？谢谢~~~

Girlmet_FISH

: l& G4 o$ l. b: u6 h/ Z
5 i# l  }6 |* S, y- S一般情况下做SP分选是不需要染PI的，如果一定要区分死活细胞，可以通过流式的前向和侧向散色光来区分，或者用脉冲宽度信号或面积信号均可区分，并且可以区分粘连细胞。如果非要染上PI，一般染20-30分钟左右即可。7 ~% t& V/ }$ S0 a4 p- d/ v

0 y; g9 _5 M1 A( Isp染色和分选中，对于分选的成功与否，最关键的问题是四点：/ ^0 ]& K  t! c( Z
1，染色时的温度，保持在37度水浴；2 S: b$ n9 w# v" E- k( u
2，染色时间：90分钟左右；
- r; [/ Q; r4 {* Z: t( H' x9 M: Q3，Hoechst33342的浓度：50ug/l；
3 i- \4 H1 b; g0 r) ?" M4，染色均匀，要时常振荡，使细胞能充分染色。
( Z! [4 O; I* [% O此外，需加一管加verapamil，50umol/ml的做对照管。
: e$ z4 b: ]' U+ P, ?1 Y+ ^5 k2 G  B% m1 k: [5 {, j

shewawa

回复 avril77777 的帖子6 E, u8 L* b  X' ]

8 q7 |) e; n8 m' g" A2 W4 N" BFACs时候的PI染15min就够了。不知sp是side population吗？就是传说中的Aria,一选就是1天的那台机器吗？那个没做过，只看过……

avril77777

回复 Girlmet_FISH 的帖子' i$ O( Y) M. m0 d! ]

; z1 o' k- J4 H* B! ?- g* g3 I9 ]$ F请问，您做出那种经典的“拖尾”的图形来了吗？' h& t  h: P0 s. l8 U. @' L

avril77777

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3 a; O6 L. \+ {8 ^# A
9 R6 x1 L+ u1 t3 M; k恩，就是side population。请问，你看到做出来过经典的“拖尾”图了吗？
& p# Y, p' g0 q# P

Girlmet_FISH

回复 avril77777 的帖子2 T3 W; s0 ]' ~' a; A

9 w' t6 J; g- V( z* a7 N4 R( s" p1 k* l我们这做得很多，现在干细胞也是热门，经典的“拖尾”就是弱染侧群嘛，有很多图都是很漂亮的，这一般跟染色有关系，不同的细胞染色的Hoechst33342的浓度不一样，一般得摸一个实验条件，做个浓度梯度！再就是跟染色过程中的是否染色均匀也有很多的关系。我们用的是目前全球据说是最顶级的分选流式细胞仪，型号是MoFlO XDP

avril77777

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; v1 _' A3 S# P$ B" @7 {
: a7 n$ m: X8 r5 b. N( h) N我看到有文献用罗丹明代替HO33342染料的，请问，你们那有这么做的吗？结果怎么样？

Girlmet_FISH

回复 avril77777 的帖子$ N8 C, b- }2 |9 L% r

, H% N" O7 {$ f% m; h. H罗丹明不是DNA染料吧？有报道罗丹明B以沟槽方式与单双链DNA相作用，但随DNA的浓度增加，发射能量减弱，如果做SP不合适吧？不就都成了弱染了。。。我们这没用过，你能否把这方面报道的文献发一份给我：rd6-sysucc@qq.com
& ]* j. ~1 n4 W6 `多谢！

shandazlj

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  R2 r# q' e* a4 K
+ l2 ^9 F0 C5 D" v( e请问你们实验室在哪儿？对外做分选吗？我是山东济南的。想做sp分选。但是这儿没有可供分选的流式细胞仪。想打听一下，哪儿的实验室对外做sp分选？

Girlmet_FISH

回复 shandazlj 的帖子2 H" [0 @8 g  D/ |8 A) j* d: E2 I

0 E- ?+ e# ^* |6 o- ~广州。。。貌似不是一般的远。。