SP分选的细节问题

avril77777

请教做过SP分选的同仁，添加PI后需要染色多长时间再上机检测？谢谢~~~

Girlmet_FISH

' l3 Y7 M  {  z3 ]# C8 S' {6 i' q3 Y7 k* o4 J
一般情况下做SP分选是不需要染PI的，如果一定要区分死活细胞，可以通过流式的前向和侧向散色光来区分，或者用脉冲宽度信号或面积信号均可区分，并且可以区分粘连细胞。如果非要染上PI，一般染20-30分钟左右即可。3 p( J' i- K" k' g" l# `1 z

8 ]1 p. P5 n1 [% z1 K7 Xsp染色和分选中，对于分选的成功与否，最关键的问题是四点：. e% H6 J0 [2 n) K- ?) F
1，染色时的温度，保持在37度水浴；5 n* l; L' f% d3 K
2，染色时间：90分钟左右；0 c# x) ~' c  X) m) s
3，Hoechst33342的浓度：50ug/l；5 S6 b, m% K# }; k/ R; A
4，染色均匀，要时常振荡，使细胞能充分染色。
8 t' t/ C" t9 `+ f, N6 s# H+ P- t此外，需加一管加verapamil，50umol/ml的做对照管。
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shewawa

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: G) ~! |" b; `6 V
FACs时候的PI染15min就够了。不知sp是side population吗？就是传说中的Aria,一选就是1天的那台机器吗？那个没做过，只看过……

avril77777

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' w. Z" y3 Q- a* A% C' b+ F2 @4 ~8 h& s$ A9 ^
请问，您做出那种经典的“拖尾”的图形来了吗？' }- Y0 S) K3 m- c# d) Z

avril77777

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3 v& P5 Z* v1 x/ D恩，就是side population。请问，你看到做出来过经典的“拖尾”图了吗？
, z/ J5 c4 b5 h3 \: D0 k5 G( s

Girlmet_FISH

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. D1 A% s/ p1 I2 x* O2 {) V, A2 z% T  X
我们这做得很多，现在干细胞也是热门，经典的“拖尾”就是弱染侧群嘛，有很多图都是很漂亮的，这一般跟染色有关系，不同的细胞染色的Hoechst33342的浓度不一样，一般得摸一个实验条件，做个浓度梯度！再就是跟染色过程中的是否染色均匀也有很多的关系。我们用的是目前全球据说是最顶级的分选流式细胞仪，型号是MoFlO XDP

avril77777

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3 u2 `& u8 A: w# ~* b9 n1 U/ Q" K% S
我看到有文献用罗丹明代替HO33342染料的，请问，你们那有这么做的吗？结果怎么样？

Girlmet_FISH

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. J( c: L% o7 S4 n6 F$ u4 B" w- @0 |7 u4 ]6 q, i4 N! }8 V
罗丹明不是DNA染料吧？有报道罗丹明B以沟槽方式与单双链DNA相作用，但随DNA的浓度增加，发射能量减弱，如果做SP不合适吧？不就都成了弱染了。。。我们这没用过，你能否把这方面报道的文献发一份给我：rd6-sysucc@qq.com
. A" B  Z0 m. x- z7 x6 `) S多谢！

shandazlj

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请问你们实验室在哪儿？对外做分选吗？我是山东济南的。想做sp分选。但是这儿没有可供分选的流式细胞仪。想打听一下，哪儿的实验室对外做sp分选？

Girlmet_FISH

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6 ], a) z0 [" [1 r3 F$ r$ x9 \9 h2 T: K3 {& d  v) ]1 |" k
广州。。。貌似不是一般的远。。