双酶切连接的一些问题

sidalin301

最近在做双酶切连接，总是问题重重，请有经验的指导一二，多谢了！
0 c7 ]  \: [, O) W% O0 S4 p, u
, Q" g8 q/ ]2 L) l3 H问题1：为什么转化、涂板、菌落PCR后除了目的条带（900多bp）外，还有很亮的300多bp的条带？
. `6 l. R8 X1 p$ K2 \# n问题2：转化菌涂板后放37度时间长了些，怎么每个较大的菌落周围都有很多微小的菌落？导致我后面挑克隆很难，也许挑的不纯，影响了菌落PCR的结果，怎么会有微小的菌落呢？这些菌落里面有没有目的片段？( t0 d: {2 v2 N- _! f& s. p

( c6 x7 a+ E0 W4 c6 I5 S
# a6 Z( `+ Q' W8 B! F3 z% Y. a说明1：载体质粒（改造后的PNL）双酶切（Nhe1、BamH1）后进行胶回收，只有2条带，除了双酶切位点之间的300多bp的条带外就是一条10kb左右的质粒条带，
  G7 q* }/ c/ c7 u9 Q8 h, B+ ^( Z说明2：我用的是fermentas的连接酶5u/ul，说明书上说粘端连接时酶量为1u，就是只加0.2ul，我感觉不好取，所以就加了1ul进去，不知道这个会不会有影响？
  }/ y0 _7 @) \

sidalin301

高兴，换了一对引物，从重组的质粒里面P出了特异性条带！只有一个特异性条带！

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子4 X, C+ l$ ^6 I9 n1 J
9 t# y& R% J0 U" H
难道不是这样吗？

chochochocho

' s! C2 R3 C2 m4 Z% j0 M7 {* P
7 M7 l3 C! k/ G! Q" d- P

mckf111

回复 sidalin301 的帖子
! A: n! Z/ F0 c9 d. \$ P2 R
8 u( n5 U) U% B7 c' x你可以小提过后 酶切鉴定

sidalin301

回复 mckf111 的帖子
5 i  m+ {7 i9 Q' G, O) F; I8 G# |0 v5 n: }) ?& ?
说的对，我也是这样想的，你的意思是说杂带是来自于大肠杆菌？那按道理说我就不用管它了，我的质粒已经连接成功了，是这样吧？

mckf111

6 e: Y7 c' @0 X

8 }# m* c0 ]! h' I7 M) e! ~; C' r回复 sidalin301 的帖子: L! e# G& e  R6 b+ U6 [
; K  F/ S3 q' k5 B0 N7 p
瞎说。。。你的酶切位点肯定是在引物的5'端 影响PCR的是3'端序列 你5'再怎么配对 3'端不匹配还是扩不出来的) S) }8 q6 g2 g6 I, a- d5 u
所以杂带来自质粒的可能性很小

mckf111

回复 sidalin301 的帖子. t7 `4 q5 k8 Q' c) h, S2 `# [$ f
3 u% K+ Z8 U: g; N( K
不用做BLAST 你用引物去扩一下它们就行了 看看有没有预期条带

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子. B( ?2 u& V6 a2 ^. q8 Y1 X
$ o. c8 h+ |  H
大肠杆菌和质粒的blast怎么做？弄了半天都显示操作失败！

jhu132llh

1.酶量过多的时候是会影响反应的
% [3 x; q& c9 i+ w6 P9 x+ T9 g2.是卫星菌，注意时间长了后就会有卫星菌的，影响挑单菌落