请教一个连接反应的问题

mckf111

最近在做双酶切 总是长不出克隆 设了各种对照 焦点最终落到连接和感受态两步上
3 W+ a) W3 F  B( @7 A感受态问题已解决6 `: n' `: v) |% H; U+ M$ R
关于连接 我突发奇想 在10ul的连接体系中取了5ul去跑胶 按照预期 连接成功应有1条 不成功则2条 我估计两样都有 那应该是3条) c) p. k  z6 Y1 t7 S+ m8 Q
可最终结果是——0条" n( T- c2 i1 \7 X  R3 y
哪位大牛能给我解释下1 t; Q' k4 T5 g( p. W* d2 x5 I
P.S.有师兄说 可能浓度太低 条带看不到 但我觉得不可能 因为我酶切-跑胶-回收之后 将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul 按照前述经验 不可能浓度淡到看不出条带 大家赞同不？？？

chochochocho

0 F. H) h7 b0 h3 k4 }. O
2 y& C" C0 P2 B+ k  q我被你的问题弄糊涂了，你说你连接体系10ul，其中目的片段8ul，载体1ul。余下的1ul是连接酶么？不用加Buffer的么？？你用的是哪一种ligation kit啊？

mckf111

回复 chochochocho 的帖子/ O) {+ E& [* ]9 B, a/ A
7 D1 T+ A' W2 \8 E) E  m
我说了个大概 准确的是载体1ul；目的片段7.8ul；10×BUFFER 1ul；酶0.2ul，总共10ul。
( j& i3 E8 U2 u( \可能您会怀疑酶怎么这么少，因为我用的是fermentas的T4连接酶（和另一个帖子里仁兄说的一样），其为5u/ul，说明书上说20ul的体系只要用1个u，我的10ul体系加了0.2ul（相当于1u）应该还超量了。。。因为没有0.1ul的枪，没办法。。。

chochochocho

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& H& F+ x1 [, N3 u  ~' f$ e9 j, X$ a9 X! R8 J
你的目的片段用什么溶解的？如果是TE的话，换成MQ。DNA浓度不够的情况下，可以先做乙醇沉淀再连接，不要用大体积的DNA溶解液做链接体系，离子杂质很多，影响连接效果。frementas没用过。我通常取1ul（50-100ng）电泳，一般不会只有一条带，还会有一些小size的杂带，但目的片段与载体连接后的产物带最亮。想不通啊，你的DNA都哪儿去了呢？

mckf111

5 `# C5 I9 D+ s/ f2 G- J
3 n0 P6 H4 Z! j2 G0 B回复 chochochocho 的帖子
+ O! R9 l* I, n5 v
# o2 u1 u& J# e3 ~# N谢谢 目的片段用胶回收KIT 最后应该是Eluent溶解的 应该是Tris 那MQ是什么？
6 m+ r6 A: p$ l5 w' p; V# H1 Y但不管咋样 我加进去的DNA怎么都看不到呢 我很疑惑。。。

chochochocho

. M; c- ]# q* B

& t1 f# u) d, E0 [( s$ a3 IMilli-Q water就是蒸馏水再0.22um过滤的那种，我不知道是叫灭菌水？还是去离子水？还是什么的。离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。哦，你胶回收之后做了电泳检测了么？估计大概浓度多少？7.8ul是多少ng？

mckf111

回复 chochochocho 的帖子1 ^' {6 L2 K( t, Q6 J" y& }6 f2 w" R

5 {3 Y7 v; o6 B9 @% a5 e" z原来是超纯水啊～～: I4 ~5 a5 o; n1 B( i% H
做了电泳啊 咱这分光计坏了 没具体去测 但用5ul跑出来 质粒和目的基因亮度相当 而且有一般内参那种亮度 我想浓度应该不会差的
3 s6 U5 I6 B% h“离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。”这句话我没太看明白 求详

chochochocho

哦，超纯水啊。如果你用离子溶液溶解的DNA，在做连接的时候你所加的DNA溶液要小于连接体系的1/3。  h) V2 Y6 Q2 ]6 m% T& K9 r
比如：连接体系9ul，那么DNA<3ul； 要是用超纯水溶解的，就没关系了，但是由于缺乏离子环境不能长时间保存DNA。

mckf111

回复 chochochocho 的帖子, ^% C4 K6 c3 e$ H' ~. ^
6 {* s9 S, g) P! s8 C0 U7 E; b
那会不会导致因目的片段太少 连接产物过少啊 不说一般都要是质粒的3-10倍么。。。
( {; z+ u5 d( y2 N: j另外 剩下来的体积是用ddH2O补齐么？看师兄们做的时候 都不加水的 把目的片段代替水猛加。。。

chochochocho

你们都是猛人结果可以么？不会变少的，你没明白我的意思，DNA量没有变，是被浓缩了。比如：500ng质量不变，体积从7.8ul到2ul。我从没用过ddH2O做过分子实验，都是用的MQ，不过我想都一样吧。