利用小分子复合物诱导出ipsc原文及简析

zerollx

    体细胞的重编程可通过 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc or Oct4/Sox2/Nanog/LIN28的病毒转染法而实现，最近又有报道仅用 Oct4/Klf4便将神经祖细胞重编程为ipsc，这是因为NPC可内源性表达OCT4.这篇研究中，我们用小分子BIX-01294 and BayK8644联合病毒转染Oct4/Klf4入小鼠的成纤维细胞，该细胞没有相关的内源性基因的表达，也得到了ipsc，说明通phenotypic screen得到的小分子能够替代病毒转染用的一些因子如OCT4，并且提高了重编程的效率（相比于去掉c-Myc的Oct4/Sox2/Klf4方法）
8 h* a7 Y9 }- o  _! {$ k4 V        BIX 与Bayk 的作用机制：
& a9 a6 M3 |* b$ {% o9 Y   1、BIX: 在NPC的诱导试验中，进一步的研究表明在此过程中，G9a histone甲基转移酶受到抑制(G9a HMTase)后，重编程的水平大大提高了，BIX便是G9a HMTase的一种抑制剂，+ i0 ^2 o, I/ h/ w  u3 U

. {* q* K' t* o9 Q1 Y2 x* r    2、Bayk 是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用。L-type calcium channels 在细胞内的不同组织内介导一系列的过程，如blood pressure regulation, smooth-muscle contractility, insulin secretion, cardiac development, 其通过CREB作用使Ca2+释放，改变cAMP水平，此外，Ca2+在mESCDE 增殖过程中也有着重要作用。9 c3 [4 i# F' c# o
       
# V/ n) ]! w( k2 G& K/ A8 ?        BIX-01294 、BayK8644、Oct4和Klf4共同作用与小鼠的成纤维细胞的结果：
6 B% f4 _  N% E5 w' V        仅用OCT4和Klf4得到的ipsc形态不明显，ALP也很弱，而且无法扩增，3 ~; |3 Y! W& k/ H% {* X
        用OCT4和Klf4加上BIX处理，在此之后的14-21天内，得到强表达ALP的克隆，而且Nanog, Oct4, and SSEA-1也呈阳性，但其诱导率明显低于 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 4因子诱导和OCT4、Klf4、BIX联合诱导 NPC的过程，这个结果表明表观修饰在重编程的过程中也起着重要的作用。8 H& z3 B; u+ h& R8 O* ^# Q4 \
        在OCT4和Klf4加上BIX的基础上，又添加了其它的小分子，结果又发现了5-azacytidine、RG108和BayK，前二者与BIX相似，是 DNA methyltransferase的抑制剂，后者是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用，而且在无BIX处理的过程中，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK是无法引起重编程的。3 y' N8 R; x8 f' Z$ e! @6 Y, m7 }; q
        . _6 s8 p" s% ~' c2 F6 k( Z5 U
        进一步确定其多能性
% {1 y* X1 f4 c- {, |" Z" h. \        用含Oct4-GFP reporter的MEF为材料，结果与上述相似，即仅用OCT4和Klf4、用OCT4和Klf4加上BIX处理时得到很少的克隆。用OCT4和Klf4加上BIX、BayK处理时得到较多的克隆，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK无克隆形成。4 w) P; Y! d, V  n
        检测其多能性：% ?6 w' i( Q; }+ ?) @
1、DAPI、APK染色和 RT-PCR显示这些GFP+OK2B iPSCs 表达了典型的多能性标记： ALP, Nanog, Sox2, Oct4,SSEA1, c-Myc, eRas, Esg1, Ecat1, and Fgf4.
( l5 o* v6 [( z# i3 ?( H% o, k2、Bisulphite genomic分析Nanog 启动子的去甲基化程度与ESC相当，与MEF想去甚远。; A& ]9 K. p% p/ ~
3、Transcriptome分析analysis showed that expression profile of OK2B iPSCs is greatly similar to the one of mESCs with a Pearson correlation value of 0.96, while significantly different to MEFs’ profile with a Pearson correlation value of 0.84 as exemplified in the clustering analysis
' K5 A& p5 L2 K* y2 L4、分化潜能:! C/ d( Y" M4 l3 Y* S/ D
      （1） 类胚体实验：对得到的EB用DAPI染色，显示三胚层均有分化：内胚层 (Albumin and Pdx1),中胚层 /心肌(CT3), 外胚层/neurons (bIII-tubulin, Tuj1).( m7 ^8 `4 T& m6 B
      （2）2N囊胚注射：将ipsc注入8细胞期的囊胚中，再移植入同期的小鼠子宫中得到嵌合体小鼠，将得到的一个雄性嵌合体小鼠与野生型雌鼠杂交，得到的后代小鼠中得到了有LacZ+和Oct4-GFP+细胞的小鼠，说明该ipsc能整合到生殖系产生精子，证明了其全能性。

stonelee2050

可不可以具体的介绍一下你们的方法呢？具体步骤哦。

flydayzhu

被忽悠了，还以为是完全chemical的。。。。。

zerollx

回复 flydayzhu 的帖子+ M) V% }! d5 }* G6 ]

# D7 G9 t- W8 Q& o, X3 X; O呵呵，那篇文章我也想要啊……

钻石星辰

你介绍的是08年Cell stem Cell上的文献。
2 b4 v+ }1 u3 g6 V: z) x8 R0 I0 F6 h# P* ^
目前iPS领域研究热点之一就是利用small molecules替代transcription factor，或者尽可能减少transcription factor的种类，特别是c-myc和klf4。
, b7 h+ D# P  i+ O1 r) m0 r7 z5 K8 V/ o3 c6 _+ Z( _/ l: D
现在最新的文献已报道联合small molecules compounds可以仅仅导入单个转录因子Oct4就可诱导出iPS，不过效率很低。

zerollx

回复 stonelee2050 的帖子
0 h6 p/ f0 W) t5 f3 F9 z' R
. V4 ]3 n4 i& P这个文献里面有，仔细看看就知道了

flydayzhu

回复 zerollx 的帖子
" F  N$ n6 u7 \1 z& o( e+ T7 w( [! l% c7 O- H7 a$ t. C# q; J& Y
恩，谢谢~

scienese

老兄的题目有点歧义啊！

zerollx

嗯，没注意与最新的那篇文章区别开来，下次一定注意！！！！

fantafiction

请问BIX 与Bayk如何筛选找到的?