利用小分子复合物诱导出ipsc原文及简析

zerollx

    体细胞的重编程可通过 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc or Oct4/Sox2/Nanog/LIN28的病毒转染法而实现，最近又有报道仅用 Oct4/Klf4便将神经祖细胞重编程为ipsc，这是因为NPC可内源性表达OCT4.这篇研究中，我们用小分子BIX-01294 and BayK8644联合病毒转染Oct4/Klf4入小鼠的成纤维细胞，该细胞没有相关的内源性基因的表达，也得到了ipsc，说明通phenotypic screen得到的小分子能够替代病毒转染用的一些因子如OCT4，并且提高了重编程的效率（相比于去掉c-Myc的Oct4/Sox2/Klf4方法）
- D6 C/ B; E/ G0 b& S2 P        BIX 与Bayk 的作用机制：) e# p1 J9 x  i$ j3 h
   1、BIX: 在NPC的诱导试验中，进一步的研究表明在此过程中，G9a histone甲基转移酶受到抑制(G9a HMTase)后，重编程的水平大大提高了，BIX便是G9a HMTase的一种抑制剂，
: {4 x3 a9 @$ P  q# [$ ?+ J" s* g* _/ }
    2、Bayk 是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用。L-type calcium channels 在细胞内的不同组织内介导一系列的过程，如blood pressure regulation, smooth-muscle contractility, insulin secretion, cardiac development, 其通过CREB作用使Ca2+释放，改变cAMP水平，此外，Ca2+在mESCDE 增殖过程中也有着重要作用。
1 C. w  G1 h8 e9 A( z) ?2 L$ h4 q* }        - ]/ S+ C' n& f* z7 U
        BIX-01294 、BayK8644、Oct4和Klf4共同作用与小鼠的成纤维细胞的结果：
/ ^% j# |1 Y8 O) @  U2 p" ^        仅用OCT4和Klf4得到的ipsc形态不明显，ALP也很弱，而且无法扩增，; b4 m) l. p8 p4 Q/ \$ @# b6 H/ c
        用OCT4和Klf4加上BIX处理，在此之后的14-21天内，得到强表达ALP的克隆，而且Nanog, Oct4, and SSEA-1也呈阳性，但其诱导率明显低于 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 4因子诱导和OCT4、Klf4、BIX联合诱导 NPC的过程，这个结果表明表观修饰在重编程的过程中也起着重要的作用。+ \  y( X" a: N3 |4 X+ B7 j, O
        在OCT4和Klf4加上BIX的基础上，又添加了其它的小分子，结果又发现了5-azacytidine、RG108和BayK，前二者与BIX相似，是 DNA methyltransferase的抑制剂，后者是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用，而且在无BIX处理的过程中，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK是无法引起重编程的。
2 _6 F. d3 u) ^2 q* h       
& y; Z3 e4 F# r        进一步确定其多能性
  m& t7 N/ V' ?5 f        用含Oct4-GFP reporter的MEF为材料，结果与上述相似，即仅用OCT4和Klf4、用OCT4和Klf4加上BIX处理时得到很少的克隆。用OCT4和Klf4加上BIX、BayK处理时得到较多的克隆，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK无克隆形成。
8 V/ x  F/ U- w8 q        检测其多能性：
7 R, {& G; i. y! I, |& a1、DAPI、APK染色和 RT-PCR显示这些GFP+OK2B iPSCs 表达了典型的多能性标记： ALP, Nanog, Sox2, Oct4,SSEA1, c-Myc, eRas, Esg1, Ecat1, and Fgf4.$ l5 l* S  ^% P5 w! L: ?
2、Bisulphite genomic分析Nanog 启动子的去甲基化程度与ESC相当，与MEF想去甚远。/ x0 ?. o0 e0 ~5 K
3、Transcriptome分析analysis showed that expression profile of OK2B iPSCs is greatly similar to the one of mESCs with a Pearson correlation value of 0.96, while significantly different to MEFs’ profile with a Pearson correlation value of 0.84 as exemplified in the clustering analysis4 o$ k8 g) _3 g/ q6 E# L7 Z
4、分化潜能:
8 u# C$ Z, s+ M1 z: Q7 @      （1） 类胚体实验：对得到的EB用DAPI染色，显示三胚层均有分化：内胚层 (Albumin and Pdx1),中胚层 /心肌(CT3), 外胚层/neurons (bIII-tubulin, Tuj1).
/ C3 m0 u* s1 T& q/ I) B      （2）2N囊胚注射：将ipsc注入8细胞期的囊胚中，再移植入同期的小鼠子宫中得到嵌合体小鼠，将得到的一个雄性嵌合体小鼠与野生型雌鼠杂交，得到的后代小鼠中得到了有LacZ+和Oct4-GFP+细胞的小鼠，说明该ipsc能整合到生殖系产生精子，证明了其全能性。

fantafiction

请问BIX 与Bayk如何筛选找到的?

zerollx

嗯，没注意与最新的那篇文章区别开来，下次一定注意！！！！

scienese

老兄的题目有点歧义啊！

flydayzhu

回复 zerollx 的帖子, I# O# B( x- u% E* |& b
4 \. [- ?  P! u" l* U; k
恩，谢谢~

zerollx

回复 stonelee2050 的帖子+ q3 `7 ^$ O# n& p; F. h
% |. s4 `, N6 d! ^- r  v+ G
这个文献里面有，仔细看看就知道了

钻石星辰

你介绍的是08年Cell stem Cell上的文献。( S7 I9 z7 W6 ~$ `2 ^% b6 @( X2 v' y6 \

# D3 B" Y$ T3 [' {# F4 [" ~目前iPS领域研究热点之一就是利用small molecules替代transcription factor，或者尽可能减少transcription factor的种类，特别是c-myc和klf4。( G* D  B2 {  p, N" f
# d( j* [3 o/ j: J
现在最新的文献已报道联合small molecules compounds可以仅仅导入单个转录因子Oct4就可诱导出iPS，不过效率很低。

zerollx

回复 flydayzhu 的帖子
$ t& N* s0 f0 x
/ p. D* ], p4 A呵呵，那篇文章我也想要啊……

flydayzhu

被忽悠了，还以为是完全chemical的。。。。。

stonelee2050

可不可以具体的介绍一下你们的方法呢？具体步骤哦。