请教mi-RNA茎环法设计引物

runsong

预用stem-loop法做RT设计micRNA引物，网上和文献里找到了两个版本的，不太一致。# ?. |  I: Y0 B4 V1 M, |6 S( z
版本一：查到以mir-145为例的帖子- A  @1 b- v$ D
              反转录茎环引物固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数八个碱基的反向互补序列。
4 j" s6 S; V" z: ]8 g' }; k; s              PCR正向引物固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG，在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列。
  \7 k6 C, l0 e4 [0 m6 O! m6 a3 a        PCR反向引物为：TGGTGTCGTGGAGTCG9 P: }: R+ e$ O; [) J
版本二：应用似乎更加广泛: F2 s0 h" a7 `9 R1 q  F
              反转录茎环引物固定的序列为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数六个碱基的反向互补序列。7 d% o4 Y) ^9 k' S
7 ~, X1 v8 v4 j1 j) {
              PCR正向引物固定的序列叙述含糊，多为成熟体去除后面2-8个碱基而剩下的序列。
% J1 N( z' c! q& f8 }              PCR反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT$ Z/ Z# |$ `% @3 h3 @- C
困惑ing...
# j& V$ h3 }* C% y, f4 v
* i3 Q3 C' c  K这两个系统原理一样，不知有何优劣。4 p) \) h2 Z5 h* v, z

& }* v# `( W- R) m" s5 A% _

gan107mz

学习了，多谢各位

细胞海洋

回复 foodmic 的帖子
, a4 T1 Q0 ?  Z2 C3 C; S3 A, `* {: z0 t5 Q
建议你发新帖提问

foodmic

如何设计特异的茎环引物啊？

wolf1978

我的建议：进行miRNA引物的设计具有一定的难度，与常规的引物设计差别较大，不是每个都能成功。最好能够选用公司现成的一些产品，包括TaqMan探针、burgle stem-loop引物等等，节省时间，把握性更大！

runsong

回复 gunther 的帖子. }' Z" O! D. v! L1 {

, W" e4 o9 T9 a( [不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。2 N+ l; |7 p% a) S/ h5 N4 r6 f
forward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。
% D# D5 j* h$ J0 o, U这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。
; Y; t8 I" a9 A2 w# I+ o6 F/ w$ h; y2 L  n* M3 d
呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。

runsong

回复 gunther 的帖子4 v1 R- j' s6 n3 M- G) j; s
/ j' c7 b1 k7 \2 k3 o; G) }
我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。
( s! U5 b& [9 x7 d其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

gunther

! ]6 o) @" P: N1 o我看文献好像前面那段并不是通用序列，不同mir的forward都不一样，真的仅仅是为了改变TM值吗？4 w1 ?) R/ u8 Z  ^0 w
% [5 `- s- _6 ]! h9 H
另外，为什么前面一定要多一段序列呢？
+ Y+ d: X( q* k+ W; t% s$ x

gunther

"而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度"
5 t5 c) u. ?) ?1 T$ G( N是这样吗？3 y5 f9 W# Z! d8 g1 n5 M2 m
所以forward前面的4~6个nt序列总是不一样。
* r) Q0 k$ z7 i  Q0 h0 @+ K
/ n* Y! K4 @) B! q; G" k3 _sunsong最后找到答案了吗？我也想知道！

王乾

我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA，我们设计了三条引物：一条反向引物用于反转录，一条正向引物，还有一条通用的反向引物，同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。
# n# T& {' V; d* ~" p: J+ [. b