关于插入多克隆位点的问题

军医

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0 [% ?8 w; p3 q8 v1 t我想在载体中插入一个有四个酶切位点的多克隆位点，用引物的形式合成了两条互补单链，留出了粘性末端，现在我把两条引物混合并95度10分钟，72度两分钟，再与酶切好的载体骨架用SolutionⅠ连接，这样做合适吗，请大家说说看法，谢谢了！

深海寂寞鱼

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$ \: O) }; ], k
to 军医：/ {) p7 N, v; T3 w
6 [1 B4 ]/ H( s2 Z/ `, p
    看来你的平末端化连接已经做好了。恭喜你啊。不知道连接处你有没有测序？
5 r8 D  }, |- C1 u' G8 O% q5 [; x1 I& @
    你列出的插入方案基本是可行。注意几点细节。
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. A0 F# o3 ?) _; I- w1 N' `    1. 你退火时的buffer是什么？7 c' a. {9 i) R/ {) v

' R/ @" b- Z& f8 ^/ q" w    2. 退火温度为什么选择72oC ？
  @  Y/ @$ G' u7 M) V( l
! ~, H. L0 t8 x; x) H5 I0 ]. A2 y    这两个问题是你此次实验成功的关键。
5 L% m; o* a% F* A3 f, w
4 {4 l0 M2 \$ v4 |8 ^" _+ I     欢迎继续交流，共同进步。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子+ K) }; R9 D) {

% @/ l2 k, t" t9 d% k( C单酶切和双酶切鉴定正确，连接处测序了，结果还没回来呢。
( h6 M# r& u0 k( u" t- O退火时没加buffer，95度后再72度两分钟，再自然降温到室温，我想应该会形成双链吧，72度应该是Taq酶的延伸温度，直接降到室温就行吧。今天刚做的连接，明天转化看看效果。
0 P+ _( U% _% ?$ R. S3 f& b, Y, c另外，我设计的多克隆位点只有3个酶切位点，23个碱基，这么短是不是不好连呀？

深海寂寞鱼

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to 军医兄：% w. }8 D" k8 _7 z+ ?9 \$ K

- g  r( Z8 r( z! i0 T! y& T     不知道你昨天的转化效果如何？ 今天早上长的克隆多么？) l5 w! o$ x/ `& X: c, h1 ~
3 a' g  Y# n6 B, t# f4 r3 E
     我个人的经验认为：
5 U3 y. \7 x4 j/ U& J: Q- M
( q) m8 B0 |8 ~$ K( l. A     1. 需要用到退火buffer，这样形成的双链效率要稍微高一些。4 T% L+ I# }6 j$ K! q; \. Q: t

- f9 B# ^4 T, y8 D/ c4 B% p     2. 不用经过72oC，就你说的72oC是Taq酶的延伸温度，退火过程没有Taq酶参与。( {( F  }4 b2 q) C
  I$ ^2 U" t4 g6 c" R0 z
         所以可以不用72oC，直接缓慢降到室温就可以了。
8 S4 o: L& Y1 r2 P9 Q, v4 f+ u. _. F' b6 w' f* \, Z5 x' D
         如果真有Taq酶参与的话，你的双链就会变成平末端了，反倒适得其反。
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. K3 o2 Z  w% d6 }  A     3. 控制载体和插入片段的摩尔比可以提高连接效率。0 |" N. Z0 O5 M. e: J6 X/ q

$ F" g$ s7 }0 e) a( |3 ?+ d     4. 减少载体的量可以降低背景，也可以方便挑克隆。" U. }# Z- D" ~) F3 ?4 S

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: P, ~: x! y0 l. e2 g/ f     总之，希望你实验顺顺利利。最好今天就直接成功。：）

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子/ [: ~3 Y& A( Y$ F- I; |! ^
5 U2 s5 n: @& I) S- `! ^4 O8 P
谢谢你的建议。今天长了8个克隆，明天提质粒鉴定一下。

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子: I1 Y8 @& \) m' z& f9 Y5 S/ q
8 F! z" G( u' \' }
呵呵  恭喜恭喜* N- f5 n5 l  n

7 W8 \- K3 v4 |8 z静候佳音

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子9 E+ j, M" {. g4 m
8 S  p+ E% s4 w1 c' p' @5 S
8个克隆有六个正确，下一步还要测个序，鉴定多克隆位点的插入方向。谢谢你的帮助！

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子% Y, w0 |& _5 u; z2 G/ p1 ]

8 j/ K& L# h6 Z$ F$ z2 `我再问一下，我又在同样的位置插入一个98bp的多克隆位点，也是同样的步骤，连了4次都自连了，序列是这个F:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA
8 A1 z) c1 \* H4 ~' jR:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA* f5 R1 }2 }( g
是在MluⅠ这个酶切位点中插入，我怀疑是不是太长了二级结构比较复杂退火不易配对呀

a86856635

/ R: |( R3 g: ]6 Z
6 E  m8 Q5 c6 K8 t
应该95度变性之后缓慢降至室温，我也做过，0.1度每秒完全没问题，根本不用72度。# [3 e6 p- n* R, a3 P! v; Z
你插入片段的mole数比载体高很多，肯定能连上

a86856635

如果只在MluI一个位点插入肯定会载体自连，载体可以去磷酸化，插入片段要磷酸化处理，因为合成的引物5、端是没有磷酸基团的，其实磷酸激酶也不贵，但是片段太短的话回收可能有些低