小鼠骨髓间充质干细胞

clairezy1983

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9 l/ k* t( l5 c$ K
- _1 n/ y. Q: }5 n$ ]0 c3 V小鼠的MSC形态跟人的没法比，人的MSC形态比较规则，看起来挺整齐，小鼠的MSC样子挺丑的。我已经很长时间不养小鼠的MSC了，现在主要做人的。
! y' N4 D& b" \3 Q你用骨片法的时候要把骨片一起种到培养瓶里，放入孵箱之前，摇晃均匀，最好三天都不要动它，可能要更长时间细胞才能长满，然后你会发现从骨片周围爬出很多比较整齐的MSC，有的时候呈放射状。你要是总是不同的观察，骨片就飘走了，不利于细胞的爬出。- l9 L9 Y& t( o# v
他们公司的protocal里面说的还要过滤，这一步也是省略的，因为要直接把骨片弄进去的嘛。
- u. f$ E! W" s8 `+ l还有碾磨的时候一定要动作轻柔，垂直用力，而且要轻，只要把骨腔打开，让血液出来就好，千万不能左右摩擦。, L: \+ ]# Y; f7 O: h
碾磨之后冲洗的时候也得温柔点，我有一次就是冲洗过度，洗得很白净，但是干细胞也没有，那些红红的血水去掉就好了哈。
) {3 [. J+ ~) o5 R& d" Y; _0 y& i传代培养的时候密度最好大一点，还有不能消化过度，很多消化不下来的细胞根本就不是MSC哈。据我的经验，MSC很好消化。
5 U; J! B( b$ r暂时就想到了这么些，希望对你有所帮助。

liuxiao2006

我用的是DMEM/F12的培养基加上进口胎牛血清（10%），细胞长势很好啊。可能与细胞株有关吧，我用的是纯化过的细胞株，大概3天就要传一代

bianhuimou

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+ i$ r0 x' h0 B. ~0 T: R2 o8 d& k' x9 v/ X1 ^0 L
是的，骨片法原代法可以看到放射状爬出的MSCs,可是传代后细胞形态变化的很丑，乱糟糟的。

clairezy1983

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  E; ?# Y- j/ p9 ~  k# Z7 r! C+ Q) X
恩，你试着降低胰酶浓度，和消化时间，不要期望把所有细胞都吹下来，很多细胞消化不下来的都不是MSC哦。

bianhuimou

恩，胰酶浓度0.25%，消化两分钟，我之前养出来一瓶可是之后就再也养不出来了。

clairezy1983

回复 bianhuimou 的帖子  U) C5 x/ S. h2 \6 q3 B

1 X8 v8 b: h( J( o( A! \# H4 m浓度有点大，降，大胆的降哈

bianhuimou

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# @9 D  a4 q8 a8 r5 g3 p$ `6 _
. P) U! _4 S; U$ E大胆的降！哦，我试试，这个细胞太难养了

bianhuimou

回复 clairezy1983 的帖子1 [$ K% Z) m0 R. f5 b
+ s& ]3 ~, z1 s9 {, i3 x( z, U
我最近进行诱导分化可是总是不成功，您有经验传授一下吗？

clairezy1983

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/ k* B5 x5 o' Y1 ~4 M$ F& J( j  f2 p; g" W" g+ h/ M/ a& ]
我现在都是做人的脂肪来源的MSC，没有做鼠的呢。我是做成脂成骨诱导。

viv2005

我做rat的，小鼠的没做过，不知道我的protocol有参考价值没，感觉MSC是最好培养的了，比什么osteoblast和osteoclast好养多了
3 a7 g$ a+ ]- i0 m3 o- r
4 b4 u5 Z( @- }6 oMSC  Isolation from Rat Femur and Tibia  a  g. s# T; E; `9 ]2 ~; g
1.        Euthanize the rats with CO2 for 5 mins.
# m) f& V) s( h" I2 F, F" y2.        Isolate femur and tibia by disconnecting them at the joints.
8 E5 ?, r& h) U+ [1 T3 A1 }3.        Clean the bones of soft tissues./ g# f2 u  m9 g
4.        Wash both femur and tibia in PBS containing 1% penicillin/streptomycin twice.( R0 R2 H( r( A7 n. P
5.        Under the cell culture hood, clip-off the epiphyseal plates to expose the bone marrow./ c1 h: y5 x$ j7 {
6.        Using a syringe, flush the bone marrow with 10 ml of media into a dish.( D, y$ @% [# X& o/ F4 @. r1 c
7.        Break up the clumps by aspirating the cell solution multiple times." ], b4 ]3 Y0 K/ R, q
8.        Using a 70μm cell strainer, filter the cell solution into 15ml tube. This will remove any unwanted debris and bone fragments.
0 B0 p% A1 \( \. Y9.        Centrifuge the filtered cell solution at 1000rpm for 10 min.
% g8 i- |2 R8 N2 `7 q: Q( i/ N- e: G10.        Resuspend the pellet and pipet this solution into a 100mm dish.
& V( ]0 y* x% C; J* O11.        Incubate for the next 48h.
1 M, H( @9 T+ W; y$ X12.        Change media to remove non-adhering cells.
' ]/ U$ j/ i: E13.        Change media every 2-3 days, even the media doesn’t change the color.
& t2 j) x' {: }1 u. f2 \14.        Usually the cell will be confluence at 7-10 days, and then are ready for passaging.
* ~, K' u" R& H. G$ W  v