小鼠骨髓间充质干细胞

bianhuimou

我养小鼠间充质干细胞已经大半年了，可是养的还是不好。细胞传代后容易老化，形态变化较大，请高人指点下。而且我应用普通培养基根本养不出小鼠BMMSC,大家帮帮忙吧

iceyang

小鼠BMSC的确很难养，使用特殊的培养液另外在低氧培养的条件下可能会有不错的效果。

pei

用低糖DMEM就可以养得很好了

clairezy1983

我养小鼠骨髓干细胞有一段时间了，建议用骨片法，建议用STEMCELL公司专门的培养基，小鼠的MSC形态就是不像人的那么好，我把我自己整理的实验方法发给你，希望能给你参考。
$ J% ~& f7 z" a8 a* w7 c原代MSC培养3 A' a" u5 H6 M8 f" L- R$ H
1.        断髓法安乐死处死老鼠（4-5周龄，雄性BALB/c鼠），在酒精中消毒5分钟，无菌取出后腿，去除韧带和多余的组织，从踝关节和髋关节处分离出股骨和胫骨，置于加双抗的D-hanks液中。
8 T! G8 I  s3 J0 r+ M1 p7 z* t2.        用剪刀和镊子彻底地去除肌肉，切除骺端。确保骨头上无附着肌肉。
- k# J" `  |6 |3.        将骨头放置在10ml缓冲液中，Buffer: PBS+2%FBS+1mM EDTA。
6 F$ p! E; z9 _0 v6 n8 F1 Y: K- z4.        用注射器尾部圆饼摁压骨头，力度要轻，使骨头裂开即可，轻微搅拌使骨髓从骨片中释出，用移液管吸出缓冲液。
! h% I# ^3 g( C8 Y. M5 T5.        加10ml新鲜缓冲液重新搅拌洗涤，去除骨髓，重复5次，直至骨头洗白，大部分骨髓被除去。
/ I# z( q* y4 e/ r) L6.        去除缓冲液，加入2ml 胶原酶I溶液（0.25% 胶原酶I + 20% FBS + PBS），预消化3-5分钟，使骨髓软化，容易切碎。
1 a7 `# K$ m# j+ q) d# ^7.        用剪刀剪碎至1-2mm，以保证释放足够细胞量。5 ~& j$ ]  A. F. K
8.        将碎屑放入50ml离心管中，加入胶原酶I溶液至总体积10ml, 或者2ml/鼠，加封口膜，将离心管放置在37℃摇床恒温槽中最大速度消化45分钟。摇床的速度设置为200rpm。
/ `, }) S7 l8 r# j9.        加入缓冲液到总体积30ml，1200rpm，室温离心10分钟，制动打开。用MSC培养基将细胞重悬浮，接种于T75，骨片也一同接种于培养瓶中，让其均匀铺开。置于孵箱孵育。
2 B2 V: e, L1 x% Y  h* o$ b- K

sping

10%FBS in DMEM/F12也可以养得很好。低糖培养基也可以养得很好。MSC培养条件不成熟，传代不宜超过10代

shqinzhu

谢谢LZ

bianhuimou

我也用的是STEM CELL的培养基，骨片法也试过，也很注意细节，可是细胞还是养不好

bianhuimou

低糖DMEM+10%FBS也试过，也养不出来，细胞很杂，不易纯化，而且细胞很易分化

bianhuimou

有养出小鼠MSC的朋友把细节说说吧，实验进行不下去了，感谢大家帮忙

zxdlala

回复 sping 的帖子1 s; S# z6 r. R

7 I% i& Z, N. [3 `你好SPING，我也用的F12，全骨髓贴壁法，但是36小时首次换液后细胞还是圆的，怀疑是没贴壁，不知道怎么回事，你遇到过这种情况吗？