蛋白银染的问题

hndxws

今天做了第一次银染，在网上搜了好几种protocol，最后觉得这个步骤用的人比较多。
' P  S2 C/ |/ |& Q1 `* z0 C步骤 溶液 时间7 }6 Q$ W' m  z- L) r$ T
固定 甲醇 100ml、冰醋酸 25ml、加双蒸水至250ml 30min4 _2 J, v* Q* P* }, ?: e
冲洗 双蒸水 3次( E( D, X3 Z" h- I) X) Z- E( s
敏化 甲醇 75ml、戊二醛（25%w/ 1.25ml、硫代硫酸钠(5%w/) 10ml、醋酸钠（17g）加双蒸水至250ml 30min
: t# k, s: h4 s' O( g2 }' [冲洗 双蒸水 3次
5 y7 h, o% a" j3 `' ?银反应 硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml、甲醛(37%w/) 0.1ml加双蒸水至250ml 20min, H9 ^: M' @6 e# d; X: T" @% H
冲洗 双蒸水 2次
$ u5 j! U" r5 s- _显色 碳酸钠(6.25g)、甲醛(37%w/) 0.05ml 加双蒸水至250ml    2-5min
7 l# ?. v1 I% f3 J$ B! t终止 EDTA-Na22H2O(3.65g) 加双蒸水至250ml 10min
9 z* R: {1 C+ ~6 m. y+ ^4 g7 O冲洗 双蒸水 3次6 B* p3 w' y6 ?2 N9 x
( f* j- a/ z! M% g# N% G' O1 e0 ?
我按着步骤配了溶液，然后染色。当我加了银染液后，没一会胶就变黄了。看protocol上说是加显色液时才会变黄，当时我就很诧异。接着该加显色液了，加了大概5分钟，胶变灰了，胶上什么条带都没有。胶整个都是灰色的。专家们帮我分析分析我哪个地方出问题了，我觉得溶液应该没问题吧。

fananran2003

胶变黄应该是正常现象，因为是有银离子的原因，你可以水洗时间长一些，银染的步骤应该没问题，个人感觉你因该从你的蛋白样品、跑PAGE的过程上找原因* ~/ e' r7 c% v+ ?3 P6 Z

hndxws

前面的过程是不会出问题的。我拿银染每条带的胶又做了考马斯亮蓝染，结果上有条带的。所以跑胶没问题。我自己想了想，估计是水很重要吧。不知道对银染过程中的水要求有多高。

fananran2003

如果你不做质谱分析什么的，水的要求并不高，显影液的甲醛是现用现加，建议你的敏化液，显影液重新配，' H6 R' q9 \1 ^# x- s( I

fananran2003

我发个简单的配方，我一直用还挺好用，
7 x- L5 d  R! P: y" n固定 甲醇 250ml、冰醋酸 25ml、加双蒸水至500ml ,30min,水洗2x2min，后水洗1h。
9 @3 {$ X4 M8 z! N, I敏化 硫代硫酸钠0.1g加双蒸水至500ml,冲洗 双蒸水 2x30s0 k& a6 `5 a4 k* A+ r- Z  P
银反应 硝酸银0.5g加双蒸水至500ml，避光孵育30min，冲洗双蒸水 2次x5min , F( L) P" _0 x, ^  C
显色 碳酸钠10g加双蒸水至500ml，甲醛500ul，现用现加。
0 R" D; M) T/ Y终止 观察至想要效果，1%的冰醋酸终止，

fananran2003

敏化2-5min就行

hndxws

我是第一次做，试剂都是新的。难道是敏化时间长了?

fananran2003

敏华长短影响不大，就是缩短银染后显色是的时间，试剂新的没问题，你的溶液也都是新的吗？想硝酸银，显色液都容易失效，最好现配，反正也不麻烦

王乾

我现在也在做银染，目的是切胶去打质谱，刚开始染得确实很烂，不过经过几次摸索之后现在染得还相当不错，总结我自己和其他人的经验我觉得银染应该注意的事项:! f* s1 n, g( H. V
1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。5 c% h( L# F* c' Z
2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。
7 A; v( D5 G% G$ V$ c6 L$ E3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。$ r/ w  m3 G" P
4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.7 r, J% G6 E7 x# i9 k
5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。1 V* @  g, M- k5 h: h+ a" T6 T
6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS的去离子水。
& p) g# f1 L6 z7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。7 I2 r1 c6 Z; L. K
8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。
; M  t" O2 m0 p% x

hndxws

避光是不是很关键啊？再做了一次，还是加了银染液后不到一分钟就变黄，后面的显色也没变化了。试剂都是新的，问题出在哪了？。# R7 c# b! E$ d( i2 U3 V
最后，我又重新来了一次，没有前面的固定、敏化，这时加了AgNO3染液胶就一点变化都没有，所以我觉得银染的避光没那么重要，以至于让胶直接变黄。我觉得问题主要出在固定和敏化，因为经过这两部处理后的胶加了AgNO3，才变得很黄的。但是，前面出了什么问题，我很郁闷啊？