求胚胎干细胞的冷冻方法

congxiaoran

回复 nculsa747 的帖子: Y: b, E$ ?: ?0 N

; q" H8 ?, I- ~, H还想问下您 那knockout DMEM 是不与SR匹配使用呢？

congxiaoran

回复 HMC 的帖子7 S( G3 n" j1 U9 R" H  {

1 v) W7 j. `2 E2 F& z谢谢啦

nculsa747

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: t# m. x3 `% Q+ H! ^* w0 ]5 r3 f, }( V( u4 o, O
knockout serum ,血清替代物，Gibco的。9楼说的FCS即FBS，hESC最好不要用它。

HMC

最好使用10%DMSO+90%FCS进行冷冻，这样效率更好！

congxiaoran

回复 nculsa747 的帖子3 A5 z; O. u7 H4 \5 S0 N

: w+ \; `6 `3 f+ ^4 l5 Q不好意思想问您 KSR是什么？应该买哪个牌子的？多谢

congxiaoran

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9 j1 j8 F( T9 X; X1 i+ J- R0 g3 [2 N. V- X2 M
谢谢

congxiaoran

回复 随心 的帖子% }% j- c' R3 F

! E7 o3 n* P0 z: F6 o多谢 受教啦

congxiaoran

回复 王乾 的帖子
) _# C9 Y( I& v5 h7 l" q; ^' Q9 B% c* \( {& j* d" b
非常感谢

随心

这边做的是小鼠胚胎干细胞，用3.5cm板养的，具体步骤如下：" Z4 r, v, i- c8 Z' b9 y3 r
1.提前将保温杯放入-20℃待用.
8 S; V4 m4 M2 e6 I$ l2.提前两小时给干细胞换液.
, u: E9 [' W: c  e0 G  j1 n3.开始冻存,把培养基去掉,用pbs洗一至两遍，加1ml胰酶消化1min。, V8 `* j7 ^; |& Q
4，去掉胰酶，加1ml培养基把细胞吹打下来，加入离心管，1000r，一般我们离7min。$ U! b% g% j# W' P5 ]
5.加入1ml培养基吹打均匀
6 H( j. y% t- k* l6，加入10%-15%的二甲基亚砜，根据细胞的多少，大概冻几管，计算好DMSO的量。一般一管2乘10的六次方左右最好。8 m" ~2 f8 k1 N! L
7，分装冻存管，每管大概总液1ml.
1 o$ Q: E$ [( ~; T" X' l, i8.把冻存管放入预先准备好的保温杯中。8 }! w) s$ }% D6 B4 x8 G
9，送至-80℃过夜。, a( V9 ?7 B( r6 |: u' G, g# c
10.第二天一早转移至液氮中，做好记录就可以了。
$ E  r; K( s* Y& i我们一般晚上冻存，这样做完直接送至-80℃过夜了，时间正好。

王乾

不同实验室有不同的冻存方法，其实只要是操作没问题，没有太大区别，下面是我们实验室的冻存液的配方，和冻存即复苏方法，希望对你有用。
6 |: [  V, o6 t7 `, ~2 b( [! E& ?# l细胞冻存（缓存）: C! |1 @# L6 W% i3 ^
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可吹打脱落。5 S8 ?; X+ r- s
1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）
, W5 P3 m# f# Q8 D: u2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:75 U, A/ }5 V1 o
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。
6 k3 J0 O: r# I3 k; A4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。（冻存细胞程序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为宜。）
( D0 t! H3 r0 ?7 T! t8 Z% @5 J7 V" L  l. C6 ]
细胞复苏（速溶）
' G; E/ C% ]: T+ S+ L冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。
' w- z8 s. p* N# K% H# G5 V计算存活率，取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。3 }9 ?$ u( L+ a; I2 U
（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％3 ?$ e+ S: G) W7 Z, m2 B' i4 Q( _