293T细胞的培养

huangcong1988

这是之前看到的，别人做过的，关于293T细胞的培养的主要过程，在此，与大家分享一下：
2 r4 @) [! }) J  r1 N3 ~（一）293T细胞的培养  b4 E* W; |' \( w( }2 A
1.293T细胞计数
3 s" @7 r  f& q- f7 L4 Q
3 P; s8 ^9 R! ]/ d1 ] 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml,在0.1ml的细胞悬液' b6 f& I" C8 }6 O9 j/ p% a
中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数
$ A! j% D% G- S! I; L0 B7 h# y细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
" T; x5 l7 }5 m' k2.293T细胞冻存; S& G. M. [3 h& k
（1)取培养2～3d生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-2×107/ml0 F- M6 N; s8 b0 e) b
（2)在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 mlFBS和0.1 mlDMSO，混/ P0 h- N* Y2 q9 U  f
匀后密封。置4℃10min，-20℃30min，然后直接放入-70℃保存。; r. u" v$ n8 g' f

4 u; E1 V! P1 A( Q/ A3 E4 P3.293T细胞复苏/ J; ]( I2 v9 S
（1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。
6 _5 \4 X9 `6 ]$ B" V* I' _, P5 P（2)迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。% q$ Y% K+ ?) j& ^( b
（3)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml1 y- f/ r6 j" j/ f
含10%FBS的DMEM培养基，置温箱培养。
: N, f: u; a6 C（4)次日更换一次培养液后再继续培养。7 f( n( d& O0 z: X- H! K
4.293T细胞传代
& z  a; R8 y' T! Z5 k（1)弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然
8 ~! ]  z5 `7 {  t# J; j后弃去PBS溶液。
8 J+ v6 W( r) S9 q/ j（2)加入2 ml胰酶消化液，消化1-2 min直到细胞完全消化下来。
/ H9 e& }1 N; v) {$ M4 h5 _（3)加入含10%FBS和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，. p7 a; d& p; O; U
将瓶壁上的细胞冲洗下来。8 b, F* B# a1 i. z) e
（4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。
8 h& V( w/ L4 @+ n9 w

nihaohao

谢谢分享

sailor

谢谢分享  补充一个小tip  我们实验室要求复苏293t时候一般会离心去除DMSO

huangcong1988

回复 sailor 的帖子+ }/ R$ O. |0 ~; g3 _/ D8 D
6 M4 y) b/ Q/ q8 `( s4 {# V" v: w
也谢谢你的tip，呵呵

ningtinglu

补充几点：1.冻存时先放入冻存盒中，缓慢降到-80度，再转移到液氮罐中；9 T' g/ o8 D; ]* P
                  2.复苏的时候操作要快，防止DMSO对细胞的毒害作用，另外要离心去DMSO;
3 A/ I( ~1 N  ?6 X( X2 W                  3.传代时胰酶我们用的是有EDTA的，终止消化后也要离心除去的。
) ]4 m' _* m4 {3 V5 y+ u. C                  4,。培液和PBS要温预，要对细胞好一点。冷的PBS容易是293直接飘起来，都不用消化了。。。。:)- Y, ^( S2 M( m  P& i) D

牙牙丫丫123

想问问你们在培养293T的时候细胞中有没有出现过小黑点，这种东西会增多。这样的情况在细胞转染后特别容易出现。

牙牙丫丫123

回复 huangcong1988 的帖子
8 F- N2 i* `+ v3 @
( Q" h* P" O! c想问问你们在培养293T的时候细胞中有没有出现过小黑点，这种东西会增多。这样的情况在细胞转染后特别容易出现。 0 \2 q9 x4 f8 |* S

huangcong1988

回复 牙牙丫丫123 的帖子8 s2 B, f& H- t
; M, d* d9 ^* \  Y% o4 x  I+ A
恩，是的，当293T养得比较稀的时候，细胞里面是会出现很多小黑点，不过当细胞密度大起来以后，这些小黑点就不明显了，我觉得这些小黑点可能是黑胶虫，细胞密度稀可能有影响，但是细胞密度大了之后，这些小黑点对于细胞就没什么影响了，现在的293T细胞株中多少会有这样的一些东西，不过，个人觉得影响不大

sccs1046

回复 huangcong1988 的帖子
: v. r; T9 h* c- i
9 G9 i# e* a+ {5 ?) r2 e! N" O我养的时候也有这种情形，刚传后细胞中黑点比较多，当细胞长密后，黑点就不见了，不知道是什么原因，不知道会不会影响细胞转染什么的？

huangcong1988

回复 sccs1046 的帖子
+ d" V  r. B* T% Q0 Q( p+ k7 B: D4 ^
1 a" {) l% L, S% I  o我觉得这些小黑点对于之后包毒影响不大，因为细胞密了 之后小黑点就少了，还有就是小黑点与细胞是竞争，也是共生的，所以细胞密度一定要保证，不然细胞会不太好长，所以消化传代那些一定要保证细胞密度