关于小鼠胚胎干细胞培养

chliu

在培养胚胎干细胞的时候，为了防止其分化，传代时需要将细胞打的很散，然后稀释。请问大家都是用什么方法将其打的很散的呢？

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关键是胰酶消化要彻底一些，如胰酶处理不好，你很难吹打成单个细胞悬液。胰酶消化前用PBS洗细胞一次，用0.25%胰酶消化几分钟，镜下见细胞悬浮，反复用吸管吹打数次即可，再用血清灭活胰酶、离心。离心后再悬浮细胞，用吸管反复吹打数次。

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胰酶浓度其实0.05%就够了，只要能将细胞很快的分散开，胰酶浓度可以尽量低一点比较好，PBS洗一下，再加入胰酶，一两分钟之内很快就可以了，敲一敲培养皿，用枪尖多吹打几次，，消化的时间最好不要太长了，如果你用血清养的，加血清终止，如果无血清养的可以加TI 终止

genedu

楼上说的比较对，不太同意一楼的观点，胰酶对克隆的影响还是有的，一般能用低浓度的就不用高浓度的，能用温和的就不用烈性的。0.25%和0.05%的胰酶以及胶原酶我都试着比较过，但是比较好的我感觉还是胰酶替代的tryple，三分钟，血清终止，离心，在吹打的时候我建议用1ml的枪进行吹打，这样会比较彻底，不会有块状出现。

前途似锦

genedu 发表于 2011-5-27 17:47 5 s2 ?8 j" L; S, P+ I- Z
楼上说的比较对，不太同意一楼的观点，胰酶对克隆的影响还是有的，一般能用低浓度的就不用高浓度的，能用温 ...

8 I' O4 z, s2 P* d# r9 n对对  我觉得一楼的方法对细胞的损伤可能不小，要是用0.25的也是加上，洗一遍 马上吸出来，残留的消化就可以了，大概30s就可以了，终止，吹打就好了。

chliu

2 m) {, ?, l% c" d* V4 a& d( r7 _# a. E4 e* L
我们用0.25%的胰酶处理20分钟，培养基终止，用吸管抵住培养皿的底部使细胞挤出来，反复很多次，结果传代后的细胞还是长3-4天左右便有个别地方clumps出来，长得还是不是很平，不知是什么原因呢？是没打散么，可是我们胰酶处理的时间已经够长的了，挤得也很厉害了

shqinzhu

0.25%胰酶20min?
3 }2 k7 m3 v$ {4 l9 K* f我们一般是胰酶1.5min
2 e. C. o3 Y0 Z+ P; R% n  Y将培养皿倾斜，就用枪头从上向下划弧形轻轻吹打，一般都很匀，放培养箱前先镜检一下，应该能都防止没有吹打散的情况。