细胞培养操作经验

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细胞培养操作经验) i0 K; `! `5 F! j
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1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题
' W% E) X( ~; B, B* v0 m" K- x2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶
3 [1 L7 H; U; a' }3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子6 ^' k+ _0 F( O" I$ D4 t7 |3 r3 n
4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）: _( R) N3 r0 U( D" _
5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境
5 w3 W$ D" i, a! u& W6 s6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁5 S% Q& ?" w+ N( r- Y# M- q+ N' Y6 J
7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
- S7 w$ l  |8 q, X" y& S8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。( C: y$ v: V1 E8 p
9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。2 v* P& ^( t2 d' [
10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。& M7 W2 W: P0 U5 j
11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).
0 J* I. V5 _2 A% c! V12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.- K& Y% \% ?2 G) Y* y5 e- T+ Z
13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平., t: e! |2 q/ y% Q
14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.6 ?& r/ i5 M+ r
15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。6 j8 y% {0 \# m. X/ K
16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.
) S  b- u4 w3 u- K7 p" c+ l/ x. z17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。; ^( s/ z, L5 x7 q5 t

9 c- U* E, c9 A                              培养基血清浓度. G5 p+ Z. X+ w( C0 t+ c9 e& m
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   关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。
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                               污染的处理
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  ~# T7 d; Y  v% N; p: I5 h8 |污染现象：) A$ r6 m( T/ D* i  Y- c) {
    细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。
3 U8 q3 E) z) ^: o, @5 \3 R. K  ^解决办法：
6 u! I5 |2 m. K# r* g1、扔掉细胞5 I; r2 G" l3 A) i' z
2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了
2 Q3 a) w0 w' ^! e% p. |3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过
8 z( i/ L6 }  U. Z$ @1 x+ Q* V4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试
2 X7 d7 o$ H+ i+ E0 f- w; t5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。: U8 H7 R, l% Q) g  q+ z1 S; e- d1 L

/ j2 I) E$ t6 Q( B" Y培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！
9 a/ l0 O  d8 B0 I$ ?0 B* C# V前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；
& s; j" X" c) l* N/ q具体可参考，培养箱的操作说明！！！！
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  Q: F% u- x1 P. Y1 V0 S0 o

ljs

这个是好东西

maomaoma

楼主总结得好，辛苦了！

xiangchou812

不知大家认同细胞操作经验中的第五条不，“传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好”。我0-90觉得等到长满了，细胞很容易就会开始老化，出现一些小的颗粒。长到超过90%就可以传代了吧？

franty

回复 xiangchou812 的帖子& ?+ L# x$ V/ R9 G3 v+ U& j3 J

7 r/ }5 j- l: Y  q0 l! C- m同楼主一样，我的ADSC也很容易就老化，我一般在每隔24h观察细胞时，发现细胞长到80%时，再过24h看时细胞已长满，然后传代。不知道细胞从80%到90%再到长满需要多长时间，也许做个生长曲线能解决问题？

franty

第9条“新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin”，请教楼主，对于在4度放置超过2周的D/F12培养基要补充的Glutamin浓度？

luomeiwuhen

顶一个，谢谢！

dandan9230

细胞养着养着就会多一些颗粒，是老了吗？我遇到过，不知道是什么原因

mayuan3012

“10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次”
2 V+ E0 G, X8 q/ L消化后细胞都起来了怎么用PBS洗呢？是要离心吗？