细胞培养操作经验

4445655

细胞培养操作经验& m; r/ B6 d: c7 v7 o
                                              , Q2 ]# W' T9 O8 q& S
1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题
) ^3 H- H* s4 c9 [  K0 x& q1 W- a2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶/ q/ [- k& Q3 Q9 P/ d) ?6 z  p: j
3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子
# t) s8 i8 @+ q4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）2 w! u" o0 g. J# m8 u
5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境3 [* ~. u% O# L& z; x& y
6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁
& q2 @% c1 j  w4 F! D7 O7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
3 ^8 K! G* s  s7 [6 G8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。) S& F6 t+ D& E; e
9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。. {5 u6 z: B# I; p" ?( Y$ X0 b
10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。& r- A; ]& d) d& @! b4 |0 K: K
11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).
' R# H+ C2 \& n) h9 U4 v12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.
5 X7 \$ }) Y0 P- q13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平." u; e! }8 V5 o, g
14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.3 q- X0 Y+ m& K1 v2 ]/ o
15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。
  D0 l7 p1 G3 c9 j16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.
* N  ]9 c6 X$ s% [8 w9 H  |, c4 Z* n8 I/ S17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。* s9 A4 P2 L" j
8 ^, p6 R2 D3 d" f
                              培养基血清浓度: u- q8 \! W) H$ @4 G1 @0 p
   
7 N  C4 g) @4 g0 X$ L; m3 Z: }   关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。- P; j8 z' l" h9 c1 l, x3 U( v
% {+ R# r7 `6 D$ R$ h/ p2 T9 j
                              
% L; P$ [/ ~/ N# M0 p* y' w  h6 ~0 c7 }1 H; n
                               污染的处理6 A9 d: A2 B: e

% r- ^8 ~. T) j污染现象：, H, P& p) S& n& o8 F
    细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。
+ Y6 z& b5 d0 T! n7 |解决办法：
3 B1 {% l# c" }" |1 p& {9 f1、扔掉细胞/ r2 w2 C1 V* ~
2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了/ q* v+ ]( I/ w2 v# M7 o! |, ]
3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过. G! u5 |0 @5 T, J1 d0 o# ^
4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试
3 j/ U( G( e4 Y9 k5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。3 N$ Y) _6 R# a  ~/ t

! [$ n5 \0 f5 R# m培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！
) d6 l+ R& s# g% M& }前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；7 R5 \- K7 q6 `
具体可参考，培养箱的操作说明！！！！' u2 `* |4 D+ |2 \( p: f: o" h" k' p  J, L
- M: |6 B% n, h! \8 g: A% g6 x

" j0 S# Y# Y- ?. J4 l' r. k( \4 L1 `$ k

ljs

这个是好东西

maomaoma

楼主总结得好，辛苦了！

xiangchou812

不知大家认同细胞操作经验中的第五条不，“传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好”。我0-90觉得等到长满了，细胞很容易就会开始老化，出现一些小的颗粒。长到超过90%就可以传代了吧？

franty

回复 xiangchou812 的帖子
. G% F( V( [$ t9 d2 [! o( k% V
; s* f  `+ l. q/ f同楼主一样，我的ADSC也很容易就老化，我一般在每隔24h观察细胞时，发现细胞长到80%时，再过24h看时细胞已长满，然后传代。不知道细胞从80%到90%再到长满需要多长时间，也许做个生长曲线能解决问题？

franty

第9条“新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin”，请教楼主，对于在4度放置超过2周的D/F12培养基要补充的Glutamin浓度？

luomeiwuhen

顶一个，谢谢！

dandan9230

细胞养着养着就会多一些颗粒，是老了吗？我遇到过，不知道是什么原因

mayuan3012

“10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次”
* @: e) b% @0 g8 u. m4 A& }消化后细胞都起来了怎么用PBS洗呢？是要离心吗？