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细胞培养操作经验+ G9 u1 g( f+ N$ T
9 h2 l, {9 R/ G+ d' W" [: ]( G1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题* w8 F8 H/ x0 \5 u5 K
2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶( N4 H( n& o1 }* ]. T m
3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子
# Z, n( o' k" ^9 ^1 C4 y! g4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）* g8 R! N7 A' S# \+ B0 u% `! \
5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境5 s. G* J6 v" P
6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁" x9 q' y- @' \3 K; B. Z) C) p
7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
7 O- p! P3 K5 I6 t5 D2 {6 q8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。- i2 |& E; R# M( j |
9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。: {# i( P2 P1 W7 L- U, {
10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。3 r( e6 Y, ^; Z$ @2 N1 c! F+ y
11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).# H6 B+ O- c3 t' E. f9 ^( W% S4 L
12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.; f; d5 N; A) i+ L0 \
13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平.
0 @* I0 I7 C0 H$ M6 \14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.
) ^. ~6 B* k( I15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。) \/ S, l# @0 V* d# I2 M
16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.1 y# w4 P- i! `1 i- c' t! A8 a
17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。9 W$ V8 @* l) }" v: x
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培养基血清浓度6 O' S: V0 l" [: ^/ r4 E) l/ w5 R
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关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。 o5 I$ p% g4 V$ ]
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污染的处理5 ]) x- t& k2 _: S: r8 H9 z! N
& V4 j! S A/ ?( v' j/ P) p污染现象：
' @/ Q1 `4 }: y. h% [' X$ c 细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。! k' h- O( \- B2 p& E) @/ ~0 s2 l6 N
解决办法：
" M( W! T+ Z+ r/ q- G5 K2 a1、扔掉细胞4 H! S* h1 P, \7 c5 Q' m) D
2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了6 j9 ]7 T) R1 I- M, s, n5 Z
3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过; F7 l; B- t# I* G* P
4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试
8 E% }5 l" P- f5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。
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2 u& y' \7 {% \: ~培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！1 e" p" R0 K/ |: v7 c" X' S
前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；8 s& E! Q# O X( _- C
具体可参考，培养箱的操作说明！！！！, T& A2 J+ O: u: d( x
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发表于 2011-6-9 12:01
顶一个，谢谢！