细胞培养操作经验

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细胞培养操作经验: W) ?5 Q! n' C3 B  B8 x
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1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题
( W% h8 M' v+ E% U/ \; J* z2 J8 j  }! Y# L2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶" h2 }1 N1 J8 ]$ b8 Z: T4 C
3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子* U1 t5 k. Q" \: A2 d* A
4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）
1 e" y; J9 t# n$ e5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境
9 y% [$ C  e; D* A  [4 Y3 F6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁
( w8 I3 G, j! i) w7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
3 L4 U8 d; X3 b4 b& K8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。
3 a+ Y) y$ l6 t( n: S9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。
! M- q, c, T3 p% L10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。" h. k4 d3 q" p  H; H- V
11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).2 D$ {: m! U$ B- U  u
12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.
, ~# N8 @( s1 J+ I9 i6 m, E13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平." y) [9 T6 m+ s9 C/ v- m0 b
14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.9 S+ S, B! }. J% }1 X- z/ c
15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。8 x+ D: e: {3 o$ `
16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.
- R7 f7 t0 C- r( n; {17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。
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% P$ z* f) y# }* f+ p! O                              培养基血清浓度
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   关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。
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                               污染的处理, z7 B. k& `# C- W: g4 b7 j" I3 O. F

; z' |& q' v$ m( u, K污染现象：* v+ U9 j! ?' d" ^5 I  j
    细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。7 U, r, U) S  X# D: E
解决办法：
+ W1 R4 o: {( L/ x- d$ P1、扔掉细胞( t" F, `5 G# K4 L
2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了  Z$ U/ M7 W- I9 s/ U
3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过6 P7 H. k$ Y% x" S  L4 [
4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试
' V0 s' _5 c  e" O5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。
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培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！$ U, e% b3 E( Y! q
前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；% Z5 @2 h# M/ ]+ S
具体可参考，培养箱的操作说明！！！！6 |8 C: {- o# u* n7 u) J' z* r7 T% h

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