细胞培养操作经验

4445655

细胞培养操作经验1 `0 r4 H3 S( f$ A6 m% s" G
                                              ( X6 a; R" U1 U% J+ }- V+ ^
1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题
7 z& t. @, q5 }6 \" q6 @2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶) l" a  c1 s1 o, c
3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子
) i+ c4 Q3 i2 j4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）
5 H  Z/ o$ s  t) ]3 {: b9 F% Z5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境0 j' ^% g( H6 t& N/ a
6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁* h* N. X4 A7 \% |4 T# @  e. k
7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。# {4 a2 H1 f; N1 C2 j: W
8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。
/ @* X+ \% ^7 r* z9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。
" c: _+ _4 w- B' m10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。8 `) c. P6 a3 K/ w
11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).
  f2 Z+ m) h7 ^, K3 }$ N12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.
* l- E+ B. \  {/ B/ N$ s13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平.- T0 X" p% C: p
14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.
# t2 [. _, A2 H15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。2 O) ^6 J: R% Y) f2 \4 t; _6 O
16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.
, m+ w9 B7 j5 I17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。
4 G, S6 g$ E5 V
, k. B6 _. k3 s0 i0 `( I1 `                              培养基血清浓度
# Q$ u! @/ `; y* |. C   
. P) m& _, O1 l3 _/ _% n( {* L  j   关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。4 G9 T1 y) x& u6 ~: A. `
9 o) X. d3 y0 R7 w5 Q
                              
/ c* g% Q8 D* Y  y, A' ]( N4 }& y" O2 v* C+ \+ |
                               污染的处理
, e$ Q5 V( I. s+ Y4 O
  p% ?4 M5 G- K" I污染现象：; K1 g( J3 i, s: W5 `* U! e
    细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。
7 Y5 t9 e4 G: A9 S3 Z& c7 y; `解决办法：
2 R! W7 t2 t) J3 c1、扔掉细胞
: [( _/ Q; p+ ?! G1 y2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了- o; @7 z) r) d/ F% ^/ _& J
3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过" I$ S0 T" q0 _) j( h9 T' C
4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试3 t2 N2 u2 K; r9 F
5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。
$ w" E5 n3 c/ I! F* g, X3 K
4 v& w% h) A. `6 R+ M培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！, ^" y8 R% L- g- C* I) R
前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；
# k& q. u/ P8 I' `- z8 T% d具体可参考，培养箱的操作说明！！！！5 \) R" |$ B; W8 G

* ?4 Z9 O. ~9 o. c8 e4 e  J2 o# q
0 r' h) k2 ^' G2 x3 V/ h
8 D8 e: u* d; A. e

ljs

这个是好东西

maomaoma

楼主总结得好，辛苦了！

xiangchou812

不知大家认同细胞操作经验中的第五条不，“传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好”。我0-90觉得等到长满了，细胞很容易就会开始老化，出现一些小的颗粒。长到超过90%就可以传代了吧？

franty

回复 xiangchou812 的帖子
4 E6 p( M# |, g( ]! B( B& `, m
) A* b& J  \1 B4 m5 h/ T同楼主一样，我的ADSC也很容易就老化，我一般在每隔24h观察细胞时，发现细胞长到80%时，再过24h看时细胞已长满，然后传代。不知道细胞从80%到90%再到长满需要多长时间，也许做个生长曲线能解决问题？

franty

第9条“新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin”，请教楼主，对于在4度放置超过2周的D/F12培养基要补充的Glutamin浓度？

luomeiwuhen

顶一个，谢谢！

dandan9230

细胞养着养着就会多一些颗粒，是老了吗？我遇到过，不知道是什么原因

mayuan3012

“10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次”
' J' z' g( g% a6 A) S消化后细胞都起来了怎么用PBS洗呢？是要离心吗？