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本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑
, w% D/ D9 F4 Q! ]( ?7 Y7 X) k
# X* L4 t' l# V% |在此省略实验试剂和仪器设备步骤/ h, d3 B' D0 I) w6 v! i" T
成纤维细胞的制备
! ~* h4 `( T9 z1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies1 C# q& Q) X/ c7 m7 G; Q, C* j
A 时间：15d
* d/ o6 z6 p1 T2 k5 s" v4 g) H) ^+ }2 p0 n（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
+ i& f3 ?: O# b$ `/ R; G（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除2 a4 ?) m$ H1 ^! u
（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
9 l3 F* J; M1 }1 p/ a) M（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min ! S$ }, l! z+ h: ^0 D
（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
. a% G) W' r' q" M7 B（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
* x/ P- I5 k \- X. B（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
' k1 T. a4 V$ A+ l$ b（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。 M: P" Q3 d1 o% y6 B L' T
（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and+ i) Z& j! X5 ], W$ ]
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
+ F; E; o0 ^9 p; ?; i- C" \" c! Q8 Z! A c$ t( D7 h' B9 V
尾尖（B）时间：10d
) }' p' k+ m1 U$ J; M在此略$ f' `- G% }$ G4 t/ T4 F8 K0 x
解冻 SNL cells TIMING 0.5 h* y3 D4 c' N4 M* X8 l7 x0 s
（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中* {2 j( R; U' r
（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
1 p1 s# Z' w4 r7 w（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）' F. G1 H, M, P1 Q
（4） 160g 离心5 min，弃上清* d; E" x; U% G8 ~* G5 \
（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2: J3 i2 @9 |% K' `3 `
孵育，直到达到80–90%汇合
7 A$ E# v6 F1 `- ^" s* b4 V! x4 e7 d1 z3 {, E
CRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。: a* @% Z4 n: k4 Y: p. C
5 g8 O8 j& w8 I. o2 I7 v! G0 j
SNL cells的传代 time：0.5h
5 j% I8 H% R/ b（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次, |! q+ ^& T3 z$ C6 g
（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
( k- Z: [. v7 i, Z（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
9 V! I3 D+ g. p7 a（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
+ b% Y9 h$ M& m) }. {7 b9 S
7 G5 ~$ y* V; ~# p/ {5 F: o' m8 oMitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h
, f2 x: d8 n6 @+ V（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1* d0 n3 l7 d; h# d4 H$ M
（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。' B* W2 \9 i; L% }- C
（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
4 C: z: n4 [7 J5 V7 _（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
! o* r- I6 G8 t5 U! @# Y（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.% d6 k9 Z1 [! r, W9 L) b* @, q
PAUSE POINT
1 T$ s* Q( s1 R( J C* s+ MThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周! `* O1 k" q9 ?5 M5 q. q* i$ `
% R7 g7 c/ |+ t解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）( _( r1 `' O3 z3 o6 h0 J9 U
（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中, ^, V& w' T% p9 `7 z9 ?$ R" d2 t
（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）/ U% d% }/ V) [+ K; S' P0 Q" ^
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
( L) ~6 F: a( c% Y( T7 W' K（4） 160g 离心5 min，弃上清
# {0 z8 f0 K( j- c4 E) M' Z- Q/ @（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
' P) a7 Q- z( Z（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
6 W: z) e( s' H% g
) p! a' `4 o0 [" dPlat-E cells传代 TIMING 0.5h
9 H$ v6 l3 L! v2 O% \（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清. c$ y: ?6 V# v
（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
. w" f' J4 e8 V G5 }( b% }% ~Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h4 j3 t* u: M1 {/ ~' @; x! j* _- @* _
（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min; |2 a( _2 F, A/ S. X% P
（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
- i5 T" p/ n" Y* i（3） 180g离心5min3 D U0 |) y$ E Q9 h
（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮3 A1 z7 q' H& M8 [3 U R0 j; v
（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml: ]/ D* F! r5 u* C& D0 t0 p
（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2) m8 Y, d9 y0 v. F6 @8 W# l" d
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h
1 |4 f \, B. N# r（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube6 v* ]7 W: f8 B
（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min( |% q% n, A6 K, ~% I# R4 J9 f% e
（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min% w u, w, D# p2 N# D
（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
; Q& }: E M8 N1 f7 S
! s+ d5 ]8 z; R3 k- t$ ~ P: |5 h5 M关键步骤: b0 L* Q! U% f, R) {; I% _6 l
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
& o# O( ]6 Q- Q& [
4 l+ r+ J; [, XDay 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h
% h* n" W! N8 d+ g吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
5 }# [7 U' a5 `Preparation of fibroblasts TIMING 1 h
$ ?& {0 z! _& M$ H p0 k1 |8 {（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）- s% h+ T A2 n/ q+ o# W
（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗
9 I4 L$ d' g# e* [（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
1 U: l# h% B' B( v4 X（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
. |& w' W' Q. j* H# Q/ X（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。
2 P! {5 e9 F) n& K& FDay 4: retroviral infection TIMING 0.5 h9 {3 y" M/ T/ d. j
（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
* k3 H( c2 D. _（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
5 m3 R# T4 Y6 Q# ^% V6 h& O2 t（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
6 e4 x; o. _; z0 \4 }; u关键步骤
( P3 `2 @, g9 D. E* C$ S8 G( }Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
" E+ I+ f( x) Y8 f; F6 d- g
. b9 c7 I! Z- s' `# e( ^（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
0 H8 _ s. ^$ O# R+ ~$ A& D0 f5 P7 j1 T
Day 5 and 6 TIMING 5 min each day
: q& l9 R9 z! I2 V7 ~" z24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
. l, N' ?. I/ F# cDay 7 TIMING 5 min
$ {' Y% ?# E6 [* m1 M6 k' j弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G4187 @ h+ O, m! B1 j% x
Day 8–10 TIMING 5 min each day
& e: y( f C1 k6 v每天更换培养基（分别在24,48,72h后）! P( f$ Z# i/ l' o
Day 11 TIMING 5 min
3 O! ]0 D8 T9 U, w$ `8 O For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1! m! k! l. v# b$ Z
Day 12 TIMING 约5 min each day
9 P7 C1 w6 X6 t1 A# x1 @0 `5 d# s% F每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）. t5 ^, _4 i* g3 A
Counting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d
3 g- T, m* { f. [) b a- u7 |- }" {（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min" A3 e3 w) L, X* r& _ k' a
（2） Wash the dishes twice with water." I7 Z' f0 {; o, U* \( H1 W
（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min+ T0 o5 ?' q+ ^* T F/ y% o, q8 J
（4） Wash the dishes with water* Q% h7 p9 M+ @
（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.
% x9 Z) l4 z0 f1 I/ ~0 C$ y1 W+ f9 u+ i/ }
Expansion of iPS cells TIMING 1 h) ]: H* C9 y5 l8 V% N1 T3 r& A7 e+ Q
（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞1 b2 H9 Q2 A' u W$ v
（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
( U( }9 V* `4 q% E) s- i* _1 \（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
) b5 i, S, g% o" U（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）. e5 j" [. O2 E0 n. Z- V8 T
Preparation of freeze stock TIMING 1 h2 G2 u- b( _% ]5 q6 O
（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗
a6 X4 _! R7 e- |" a9 ^/ z3 o（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
" Y( `: e6 [/ O# r& O: H* z! w（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
4 ^: E: v2 {3 H- t（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min% d+ y9 q5 W0 }/ g. N& J% [
（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
! j$ t$ c& s( T9 N! S（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
% N# C6 ~. k0 N- {. b* g（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
; [, S" i2 O8 w' A( b' Q（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
d1 q3 m \- q1 M% wPAUSE POINT
# ~( M o- G+ e4 g+ T: M7 `For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank." o6 |/ x" `) t- d3 r
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发表于 2011-6-10 09:06
