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本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑
6 U! e* l) v: i! Q4 i- X8 ]
1 \+ J4 v Y* M6 Q) L7 K G3 T在此省略实验试剂和仪器设备步骤7 l8 W# e5 ^! |9 ^& _; J5 c! i
成纤维细胞的制备
. Y0 `) C+ t) P) s1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies X7 O. z) O3 c* q: Z) z# U8 t, m
A 时间：15d: S, I( m/ Q! U' w9 R
（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。, k% l% ?* j! ? L! q
（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
0 v! m* R( O* V$ w（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min ( g: K6 \0 L, R' a
（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min 4 B% t) c8 X6 \) S2 t# m
（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
2 ?( y* v, ?/ ~% A, h9 n（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。6 ?( r& O" ?. |9 e: T1 x r- m' q
（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)1 N4 T! l" u% e
（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
" O$ \2 ~: h% s1 Z7 k7 X' p; M: ?（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and' H: t, g3 u: P: l5 n" u
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
, x$ D' p! Z3 Y: o
" G! G& R( M3 q: A& H5 r. ^尾尖（B）时间：10d$ K; c% X" F3 h. F$ M
在此略
8 M( }# v( b( f$ O# D B解冻 SNL cells TIMING 0.5 h0 X2 H8 n2 P+ h9 M
（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
1 S7 N. m. b7 P! Z8 ~0 Q. d8 q（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）7 I6 f0 `% h6 D8 _
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）5 n9 z) h0 m/ {; {* e7 ]" a
（4） 160g 离心5 min，弃上清
$ J1 ?) z" ^% a（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
0 l V2 w+ P! ]8 \0 L& c孵育，直到达到80–90%汇合
0 h& z3 D9 S X2 ]% P+ n6 `( n: y
CRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
6 d2 B$ R5 O' K& N5 e9 U& R9 O6 G$ ]% E0 M2 X( @
SNL cells的传代 time：0.5h
# R: R! D7 d( E" W（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次, S+ f9 Z! U* J3 P d$ k h7 D
（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min/ O! u; q" f( h+ J) Z& {
（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞" w0 I7 F* H3 v( C m$ V
（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
7 T6 @# v! A0 u4 M* E) n2 ]% S3 c' F1 y5 _" t6 `% Q
Mitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h
( I' Q+ O6 c6 Q& b; r（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
3 P: O" C4 a6 l1 t3 t% m3 a（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
P0 S/ i# y) ]（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min' z; {; K! P$ G U- X2 X& C( V
（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
0 ~# a w6 p* {: x5 w8 `- O/ D; ^（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.8 P1 ~1 m0 p: I5 G( X# \
PAUSE POINT
* v: J8 r/ {: F2 sThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周" t/ C0 p6 m! m. G
/ B4 d. ~8 O6 J+ W2 e9 N
解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
3 W2 x1 b! T- V% |# S（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中
6 y& H" n: Q K8 K. X$ l% m（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
' r, g# j6 K# N, z（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
% l3 N% N; J2 O3 j& O |, K（4） 160g 离心5 min，弃上清
4 ?& F% P9 F3 [2 T3 T2 ?, P' i（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育2 f9 h3 i$ H S* ?7 ]0 T" v0 A
（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合6 e7 c0 V' r5 ^' Q; X
& r. g4 l& Q$ O* ]7 m, ^; o
Plat-E cells传代 TIMING 0.5h
0 w1 Y# d, \* \$ Q8 W6 z（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清9 @" G5 H; u$ k
（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合( ^1 _' R4 M' l7 H, Z6 Q
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h
, v! u! |+ V" Z0 j: [! g7 A) S- z（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
3 K7 G( G& y9 ^. y, q+ n（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
l# m- D0 i5 G7 U9 A（3） 180g离心5min
1 L+ o* U" G6 a6 Y（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
7 \8 f* r T% ~: Z4 z, j（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml1 w: a; ]7 w. |0 D% M
（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2" n& t; q8 L) I
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h$ S5 N, d+ U: B2 B) B
（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube& o3 Q6 z1 U! R7 @. z5 B: N
（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
2 T& r; S# \! t& i G（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min0 D" Q7 r, f+ M& B* L
（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜2 r. o3 k# [. `3 D1 U
1 n+ @# Y7 X, Q; v; @: d1 Z7 \关键步骤7 p( d& x" R( |' c, M
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
$ J9 L* ?; ^8 T' {. ?. O1 D/ f4 F6 G1 |" C3 b9 [$ s0 _
Day 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h x7 h3 B. R; M5 s6 m. E% d" |
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator; W! ?( U' L/ f1 T) j
Preparation of fibroblasts TIMING 1 h7 h; I3 _( J- z- y( E! d( _
（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）+ M3 {' a! \" {
（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗
& g3 l. r% a6 T1 i/ Y（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
, \$ G9 }. O1 ]# w8 M' z; I& E5 M（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
2 t- m7 T) I) z4 ~ B8 g' V2 s& `7 w（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。
2 G; ~# ?3 u0 V. y( pDay 4: retroviral infection TIMING 0.5 h4 Q5 Q `3 R& \
（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
& c1 }9 T( @ |) [（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
( }$ {, F& O' L) {. D- v（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
& x/ ~9 E" s+ G* U6 R关键步骤, z6 m4 q5 A; X. a7 z/ w
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度# E; C& ]4 k# q
4 H# x* w w" C（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜2 s/ f: M& A: p+ R( v4 C" [ f) [7 o
+ h4 ]# G, `( c: s5 TDay 5 and 6 TIMING 5 min each day
/ z' h% s5 g2 d24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
" h/ x! r! f' j4 A6 \. _- Q3 oDay 7 TIMING 5 min
, n1 X& z& q4 b! \8 z& A弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
3 V4 |/ K4 n, fDay 8–10 TIMING 5 min each day$ u! X% q7 \5 u2 L- z. ]. O( j% f
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
* u5 u: v8 Y/ t1 p3 |$ XDay 11 TIMING 5 min
) F4 E/ r# j! e2 |/ P For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1" P+ ~* r6 K, F, @, g, I
Day 12 TIMING 约5 min each day
, s9 p G1 a; j' q) G- [; y每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）* |8 S& X; ]7 T4 m* c0 B0 h
Counting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d+ L% y) z, Y' t/ p
（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
3 t( L% r3 ^8 ~2 _% f3 _（2） Wash the dishes twice with water.
; N/ R0 H; m- D（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min% \( }2 D' c0 N# k
（4） Wash the dishes with water
: N. z/ C! y% {8 b, K, v（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.' v" c) [1 y% ?8 J0 a; D
8 c! e W1 h+ ?! M$ y( [% W
Expansion of iPS cells TIMING 1 h' R7 U9 O7 t; s/ J) N4 |
（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
- N h- g1 v0 O) e+ Q（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
6 a/ G6 q1 E2 d（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层& k/ Y! x6 p+ S; v; d- b
（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
/ n- C7 k3 e4 M5 l x4 ~9 L( WPreparation of freeze stock TIMING 1 h
9 h$ }5 L2 H* S0 s8 S（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗
5 Y! t9 h, R5 @（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min# S6 x$ x- ]8 S% G1 Q2 e
（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层9 `- ~: Y% o/ t. |$ p% c
（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min( t! D$ v( b2 J! Q; H
（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
' A5 c. G6 w8 |# ]（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）4 U1 m* w7 b1 M- Z2 v
（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀1 `2 E% y( i) H; M" I
（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
/ F4 S2 d7 g: @ e- n! CPAUSE POINT
7 P- u1 l. j7 }# E4 bFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
$ q* P: ]+ g' ~# G |
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发表于 2011-6-10 09:06
