又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

' T! p: o2 t# L
) x2 }* P# t' F9 T1 S
在此省略实验试剂和仪器设备步骤
$ b2 o# k( w. ^0 R1 H) k( P成纤维细胞的制备
& I" u! H9 j3 Q: k8 e/ i1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies/ w# e$ F3 c% W. G2 V7 Q) f, ~, ?
A 时间：15d
; w$ C0 q8 t1 W; f7 v$ e（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。$ x1 c/ L: r5 J, N6 W
（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
8 |) c+ {5 @6 l（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
9 \' Z1 \3 c6 A( `) z% y4 V（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
2 W* u# n. [5 e3 {3 ]8 b（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开5 M$ L+ H; c, S, `7 ?; y, A
（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
& ]2 G& d/ o1 x; K（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)( Y# L9 g; L& A/ t1 G" w
（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。0 e" R- T1 ?, Y
（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
( ?3 \# g; X4 P0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
% E9 L, ^' a! J; G4 m' J! ]
) V5 |8 C6 C" D9 y- h. J- k尾尖（B）时间：10d. }& G; _& T; o) \; ]; K8 O
在此略
) c2 U2 ^" o5 w解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h
7 o* F) I, {) g7 P* V) z4 a（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中  P6 h! @" @2 q. ?& q1 X. r
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）( ~; Q5 L" _, K+ w0 b3 w/ {
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
' o2 M# P* p7 h（4）        160g 离心5 min，弃上清
. |, Y$ P# K% {3 `1 B3 e# N3 x/ H- t（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2: j. Y" Z9 \+ n/ i$ K- \6 }
孵育，直到达到80–90%汇合
# P, J1 {# O% O4 [5 o+ {1 ^4 E# O% i; [# g; a
CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。* z) x) B  e) ^1 H

& E  g4 V3 s# q4 e% JSNL cells的传代 time：0.5h; y8 k0 z- l" H
（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次
! d+ c: s: n4 O! t（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min- l0 _4 L% A4 ^+ P+ {
（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
, v+ _( F7 f, e" R（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage1 x5 R$ q/ q6 W) [; x; ?
0 {% R* T' }. K- j9 _8 u2 c
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h+ O/ ?7 Y6 L! P
（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–18 V0 G9 F* g* R/ u
（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。+ Y0 ^9 T( T5 \9 `- B1 s
（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min3 m6 @* v& }6 w: H* T. Q( D
（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
& k/ g  w; e" }( f; b（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.$ b7 p2 Q9 H1 X/ q; ~8 a' D
PAUSE POINT( K* x# W% c3 ?& s( q! c  H$ ?
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
* l6 u& d5 y# P0 M& U- w7 w' Y1 ]& y4 Y* D
解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
: o' t7 l) E  s) P- H( G（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中3 z! g' M. {3 `1 A
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
% P1 o5 v. G+ R# q. W（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
  p9 s0 e0 R5 g（4）        160g 离心5 min，弃上清
0 ?; K, F2 q# b4 h' @* {  K! w（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
. [( N. _6 r1 f/ T: y/ g: ~* D. R（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合/ z% ^* g6 O0 W) f! ?; g. ?3 K
1 h1 j7 o" Z3 e' j( i2 N
Plat-E cells传代  TIMING  0.5h* N- Z( C5 k3 z
（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清/ H0 W& W4 C/ O& C" D0 J3 n& b5 b
（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
! Y3 q8 g* N, L4 nDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
7 e+ }/ a4 x+ _/ y（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min0 ]8 k3 W: c2 V$ W8 i8 H
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
) f" v+ ~! X6 i( H2 U' H（3）        180g离心5min# _2 A: E, y/ l5 j
（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮2 H/ M4 H# ?" Y/ F) a: ]% C
（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
! U4 f  c/ S; {! z5 W% ~& z* r. V（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO28 j; k; h+ p& ~& C! Z, H) ^8 h
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h
9 `+ B# L! w: w+ A' j: u. W（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
3 `3 Y: r4 y8 q" d: p（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min0 r; M/ ~$ i" q8 t! B
（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
8 T6 M$ M* a; a（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
! X  P" l3 B7 e& M# P7 ^+ T
, ^9 Z% ^7 H* e/ k关键步骤& ~/ y! h$ U) J; L6 m- P6 G
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction  }7 v8 G2 g6 ]! C& n# U! D9 ?
7 k! n! L1 i2 o6 b: d
Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h4 ~. Z% G8 `( W) Z; B" G5 R
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator) l3 y7 S1 N& T+ L
Preparation of fibroblasts  TIMING 1 h
* N: \5 ?6 I" H% F% ^（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）7 R1 w. ^; D/ `. m& T1 u) X, _6 g, i
（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗
  d1 V; U5 ?/ t! C) q8 \( o（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
: d. N7 a. c6 k* J, P8 U（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中% B3 M# X8 x1 @+ g' }
（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。  Q# y" R4 A* p" Q! ?2 e! ^/ L
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h# f. f5 M' B; ~
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
% a6 r4 w$ c: I( ^) T（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
1 A6 h9 i1 {( P7 w（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.6 H3 L4 U5 A( _' @9 {! ?
关键步骤
7 s/ \" k5 {. y: K" O' oRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度& g: k8 j, c0 r. i- u+ P
+ s; `, D( ^& E
（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜7 m* p5 ~' d5 Z
, U$ o! N2 n" h- R" Y3 |  h
Day 5 and 6  TIMING  5 min each day
; }& F* P1 O  [24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS+ W  o  R- k+ x: ~
Day 7   TIMING  5 min& b) s5 A8 K+ O7 `5 _
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
& T% u4 e( A5 B2 h4 X* U" A6 l8 ~Day 8–10   TIMING 5 min each day
; l0 `9 ~. @/ a6 g  R每天更换培养基（分别在24,48,72h后）! H/ `2 t, r  J! R3 Z: b
Day 11   TIMING 5 min
: o5 \& @8 {' k( X7 B6 h+ R( m9 s For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
/ x5 a- ^" Z0 B- W- u' YDay 12   TIMING 约5 min each day
8 B" |+ A1 _5 K* a每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
: l, m9 ^$ {" hCounting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d. x( c: s& ~3 o! N: Q, M
（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min! D1 \5 m: p  Z. y- O
（2）        Wash the dishes twice with water.( x7 P* c, a( ~4 j8 V( X
（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min0 A' _: j$ B1 s7 `) {3 ^
（4）        Wash the dishes with water
" p: {5 p6 Y9 J  m$ Z! a（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.8 c% V) R, H4 K2 N0 O- v
- \" x) q8 {6 n0 T4 o+ I( A
Expansion of iPS cells  TIMING 1 h; h+ [1 h9 M$ Y- W- M' y% A& Y
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
7 Y0 |  r3 o2 L8 b* d& ?0 V（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
/ v6 `* t( y# q" Y# H6 k（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层+ |: l9 G' u+ Y* c7 ~% u6 l
（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）9 j) o. T6 ^4 i. W. o
Preparation of freeze stock   TIMING 1 h
# Z0 q2 ]4 R; a( D, z& o, {# u（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗1 Z$ w% d1 e/ J2 k, _3 X
（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min/ R' D# V+ c; `0 m
（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
; k) |/ C( }7 u7 x+ G8 ^（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
; U" Y& q% Q3 \4 r（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
6 b5 e1 N" W1 ~: M（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）, E6 h0 ~+ A5 e6 C/ k  C' L! R
（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀' S' [2 x$ f5 `2 H. W: q/ a
（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
+ i' l7 y( M  F6 j6 t- t2 p. z9 `$ I2 oPAUSE POINT
( F$ U9 J) S3 b7 RFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.% e5 Q) U2 H* R" h0 m  B; ]

sunny2829

什么时候的呀？？
9 U' {4 {' l1 L% A2 ~8 m+ d

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子
/ A9 N* l1 `  k& t2 Y8 q' e# m
1 l  P- D) T" H+ E! a. @# u这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子. M5 }- ^& s8 Y4 `% H

3 [0 y1 p7 c3 w- d呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。) _& s  w0 h  B9 H# u1 t4 a
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
0 r, e0 c8 }4 j* m新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。3 T, i' a6 f' o7 r9 [
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
6 |8 S& e- X& d8 D3 L% A新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子$ s2 _9 T1 T$ G8 e1 a
) x$ O* P5 E9 h
呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是8 g4 P7 C$ l: s. s' K3 }
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是& Z" f: Q7 h% u. u6 u
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生
0 O8 m; D6 Z5 @& v7 E最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

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  G; \' G% q$ q9 y$ a
1 D. E3 t$ l$ e: w+ [$ Q" c7 n. q太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
& i8 R0 c4 Q" O1 R6 Q" E1 a/ v: ~! \! o3 X0 f5 P
没事，相互帮助嘛