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本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑 3 a1 H7 S* x6 w% u; m; ^ E+ v
3 y# E: B# ^/ c在此省略实验试剂和仪器设备步骤
; |: @# s' ^$ h. _: K! d4 O V成纤维细胞的制备; a( a- X3 y8 ]1 j7 f) i4 K" E! T1 G; Y
1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies9 ^" D# k4 r7 Q2 Y! Y+ R
A 时间：15d
2 e0 z7 n+ J: V( U& V4 t（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
3 v3 L/ c5 k& J（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
/ |# H# A) @. O. q（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min + X+ N( K9 ?/ r/ i5 F. g5 P- r
（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min : C7 s" P) ?4 j' E8 R
（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开- c: d- W# }2 p$ ]# s f o
（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
C$ _, y& o h& K. u（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)6 k: A' V) o c
（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
% c# D& l9 B8 c' r8 t1 ?2 b（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and: e' V( y4 [: y5 }. ]+ K3 Z3 H
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
: g M% B% m" h& S" {; A
0 q7 T" W7 Z# D* w) D尾尖（B）时间：10d f6 t9 z' P1 g
在此略2 F: ^; O$ Q+ @% n7 }
解冻 SNL cells TIMING 0.5 h
# }8 x2 m2 e( ~0 G（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
6 V5 j' L, Z! D8 }（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
6 C% }# z; [5 h（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
* v' f: z; \' Y7 l7 W( U, e（4） 160g 离心5 min，弃上清
8 y8 m4 p& [, z$ `4 q; s3 T（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2) d* ~2 E9 I& p! b9 R3 M0 p* x" K
孵育，直到达到80–90%汇合
7 k* B7 X9 i2 Q1 D
$ U ?0 [' a, j- P: NCRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。, g: U0 `8 L. D$ z) D7 d, {$ i o
3 l3 n! T/ ?- |! U; z; Q
SNL cells的传代 time：0.5h }- ]2 p! J+ r$ `; y% ~
（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次
7 G7 S( q6 X4 Q9 e（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min1 Q0 E0 l' N: }4 A9 O$ Z1 k
（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞; j# F# l: C3 d% H
（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
. b! w3 D1 k4 p6 p
+ ^& A3 F" ]! X1 ~Mitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h
0 q* M3 T% }! u5 Q1 H. F; r（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1' ]: t- W8 E& s- S) y# j
（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
( p# D7 }# ^3 S M（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min% U3 V& B' c8 A }: {7 D* u& U6 c
（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
% _" e% {8 k# M5 S8 p（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
, b* E1 s' C3 ^: s( F2 l/ zPAUSE POINT
6 P1 i" i& e4 ]0 n hThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周. l4 V, p& M8 s) ]6 n }
# I! B0 c. {' {( }. t) [% T5 C
解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
6 g3 l3 {! q# H. ~+ N（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中+ E+ G' B2 S; o+ R2 H4 X
（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）. U" s. Z& O3 m5 N/ q) v
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
( w- D4 O6 |2 @（4） 160g 离心5 min，弃上清
4 ~. R" s: b C. |9 i$ [（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育6 t* N) p9 P9 d1 s. |
（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合- r8 B, p3 J1 h% [2 k2 j, U
5 r# a& @( i7 c" s; ~% CPlat-E cells传代 TIMING 0.5h0 x- f; w3 T/ X) [- n. c
（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清 l/ p$ w' q& o9 l2 b# |/ L' d; V# z
（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合) C$ j7 M m K4 T7 Y
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h: H9 G6 l9 J$ P; t; l m
（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
! ~9 P- K6 f R/ I' w（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
d9 `/ H$ F5 w& d8 N（3） 180g离心5min3 T. p+ P3 S, S3 \1 a/ W
（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
3 e$ r b8 c( h+ G" t+ o; [（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml1 ^ x" p- `1 z R4 J \
（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
5 R, Y- E# ?8 t3 n+ F& m! t# RDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h# q: I1 z: N J% P/ v1 _9 k
（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
* I' f# G; u% b" Q2 ?（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min+ g: I$ O( Q) I* F# X
（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
! m$ n( P; n0 P* a0 t* g- U9 i（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
2 W9 K* p. k, d* X4 g1 x$ x, y' J% T3 d( F9 ^$ x5 H0 x( ?
关键步骤1 K. e' @# B: A4 U- _
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction k9 X& u' n' A6 J) J# g
( R. f! b- P( G+ zDay 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h
5 e2 b: f/ u$ E& _( S9 [吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator+ ~3 o6 S. @' {/ l
Preparation of fibroblasts TIMING 1 h4 i. C. p8 B4 h
（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）5 F: X: h2 f+ @$ W$ w) p) G! V" z
（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗) o, z2 V* X' K+ Z
（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
+ G; {3 }, D: Q7 T; {* [（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中1 S; \0 `+ ~" \6 r" b$ D7 y7 k
（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。
1 R1 y& _3 q5 g3 u# dDay 4: retroviral infection TIMING 0.5 h
- t$ ] U! Y2 e+ q) s（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。* Y( L8 P4 M6 U# C
（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
! h3 y( D0 P4 [（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.# Z; {5 U* J# G6 L3 Y; I( q f
关键步骤! N8 i4 u5 V; X% d' {3 L7 r! d
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度5 `1 `" ~# _; E9 ^& f
# I) S8 ^( E& I, k2 M2 Z1 a( z6 u
（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
, \7 d! l+ A' {$ k- V ^# g+ c. }9 B, `, j* v" x
Day 5 and 6 TIMING 5 min each day8 ~) }8 d. O G, O: |. o$ T3 @- H" f4 r
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
) G3 K0 ] L9 g; `, F$ Y9 {Day 7 TIMING 5 min* X- `& h5 f4 ^! v
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418( r7 I7 q2 I( t5 Q- ], r
Day 8–10 TIMING 5 min each day4 \9 u5 w& x( T2 ^. n& g* N; G
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
8 {& U' c2 U) Y/ F2 o+ o7 ~Day 11 TIMING 5 min2 g3 n W1 Q: h( g! X% S
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
( h) K6 ] j; ?& S1 k' UDay 12 TIMING 约5 min each day
& u3 R( d6 m( C每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）3 l2 @" }6 R* p# O1 H U) V
Counting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d3 ~2 {8 E6 G" n) r
（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min. v5 g [/ b" G) B- @% P9 O% G
（2） Wash the dishes twice with water.
8 }1 L5 h" z: E" U（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
9 {5 j/ N% K2 M! w- U8 W（4） Wash the dishes with water5 |" B3 J: U+ I6 \. D+ f
（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.; W1 R6 u, d6 m7 X( @. l
/ G$ W0 |- c9 c9 n8 pExpansion of iPS cells TIMING 1 h
4 U5 l( ?* i& E3 _! e（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
$ T$ j2 P5 C' f- z, N+ f9 Y- L（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min4 B3 i; @- u, f
（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
5 w5 L% k% U$ ^: c* r（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）$ u" E! G! A% F" W
Preparation of freeze stock TIMING 1 h
1 {. k; l& L% z# p1 j/ l（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗" i: @. \9 j- d$ e
（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
. g# A, q3 V1 k9 j: e/ J! H（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
* m9 U( w* X/ j/ i（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
: M) T. S7 s; Y3 W1 M* u（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
( c8 t* |% h8 [$ _/ p' {7 D（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）. u9 T9 m+ T3 ~' d; y, h
（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀2 }" l, r9 N5 [' I
（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）( ^* v! ]8 @ g
PAUSE POINT
; s, v; W1 U5 [, E* kFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
) M8 t3 ?3 @+ V+ h, z' h+ X; g |
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发表于 2011-6-10 09:06
